秦 笙 王玉濤 孟少偉 許振杰 關(guān)文達 陳 茶 楊子峰 江海明

1.廣東省中醫(yī)院檢驗醫(yī)學部，廣東廣州510006；2.廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院廣州呼吸疾病研究所呼吸疾病國家重點實驗室呼吸疾病國家臨床醫(yī)學研究中心，廣東廣州510230；3.廣州呼研所醫(yī)藥科技有限公司，廣東廣州510663

HEp-2-NS1改良細胞分離6種常見呼吸道病毒的敏感性分析

秦 笙1王玉濤2孟少偉1許振杰1關(guān)文達2陳 茶1楊子峰2江海明3

1.廣東省中醫(yī)院檢驗醫(yī)學部，廣東廣州510006；2.廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院廣州呼吸疾病研究所呼吸疾病國家重點實驗室呼吸疾病國家臨床醫(yī)學研究中心，廣東廣州510230；3.廣州呼研所醫(yī)藥科技有限公司，廣東廣州510663

目的評價HEp-2-NS1改良細胞分離培養(yǎng)6種常見呼吸道病毒的效果。方法以HEp-2細胞為對照，HEp-2-NS1改良細胞分別接種6種常見呼吸道病毒，包括甲型流感病毒（IFA），乙型流感病毒（IFB），腺病毒（ADV），呼吸道合胞病毒（RSV），副流感病毒1、3型（PIV1/3），通過血凝試驗、細胞病變法分別進行病毒滴度檢測和觀察細胞病變（CPE）；使用533份急性上呼吸道感染診斷的患兒咽拭子，對HEp-2-NS1細胞分離RSV的陽性率和出現(xiàn)CPE時間進行評價分析。結(jié)果①病毒滴度：血凝試驗結(jié)果顯示HEp-2和HEp-2-NS1兩種細胞中IFA、IFB滴度均為1∶8，PIV1、PIV3滴度均為1∶4；CPE結(jié)果顯示，RSV在HEp-2和HEp-2-NS1培養(yǎng)2 d后病毒滴度分別為（2.67±0.16）和（3.67±0.20），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；ADV在兩種細胞中培養(yǎng)3 d后病毒滴度分別為（2.67±0.18）和（3.33±0.49），差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。②CPE檢測：相比HEp-2細胞，感染RSV的HEp-2-NS1細胞培養(yǎng)2 d后即可出現(xiàn)局部范圍的細胞融合病變，病變范圍占全視野的30%；4 d后可在鏡下清楚觀察到大范圍的細胞融合病變，病變范圍占全視野的95%。③臨床標本評價：HEp-2-NS1和HEp-2兩種細胞對臨床患兒咽拭子RSV的初篩分離率分別為7.50%和3.75%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；CPE出現(xiàn)時間HEp-2-NS1為（3.77±0.90）d，而HEp-2為（4.66±0.80）d，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論HEp-2-NS1細胞是一種新型的RSV鑒定細胞，為臨床實驗室快速分離培養(yǎng)RSV提供了合適的工具。

病毒培養(yǎng)；HEp-2-NS1細胞；呼吸道合胞病毒

目前臨床實驗室對病毒分離鑒定技術(shù)的認識仍較為薄弱，但另一方面臨床需求卻很大，兩者之間反差明顯。2009年4月人豬流感病毒流行，由于當時為新現(xiàn)病毒，PCR等方法均無能為力，WHO指出病毒分離培養(yǎng)是最可靠的方法之一［1］。利用呼吸道合胞病毒（RSV）非結(jié)構(gòu)蛋白NS1對干擾素負調(diào)節(jié)特性［2-3］，筆者構(gòu)建了一株穩(wěn)定表達RSV病毒NS1蛋白的HEp-2-NS1細胞［4］，從細胞增殖、干擾素應(yīng)答和病毒敏感性等不同方面對該細胞株進行評價，并進一步應(yīng)用到實際分離鑒定工作中，務(wù)求使基礎(chǔ)研究的成果轉(zhuǎn)化為臨床研究的有力武器，實踐“臨床與基礎(chǔ)有機結(jié)合”的研究模式。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞堯病毒

改良的HEp-2-NS1細胞由廣州呼吸疾病研究所呼吸疾病國家重點實驗室楊子峰教授提供，細胞對照HEp-2購自上海細胞庫。甲型流感病毒（IFA，A/PR/8/ 34，1ot：7389612），腺病毒（ADV，G.B，1ot：7512088），呼吸道合胞病毒（RSV，B/Wash/18537/'62，1ot：5271356）購自ATCC；副流感病毒1、3型（PIV1、3），乙型流感病毒（IFB）為臨床分離株。

1.1.2 臨床標本

2010年6月～2011年2月采集深圳兒童醫(yī)院533份符合急性上呼吸道感染診斷患兒咽拭子。采集后的拭子置于病毒運送培養(yǎng)基內(nèi)，以冰盒運送至實驗室后分裝存放于-80℃。

1.1.3 主要試劑

細胞培養(yǎng)板購自CORNING公司；DMEM和胎牛血清購自Gibco公司，DMEM完全培養(yǎng)基補加終濃度為10%的胎牛血清；甲苯磺?；?L-氨基聯(lián)苯氯甲基酮（TPCK）-胰酶購自上海國源生物技術(shù)有限公司；0.75%的新鮮豚鼠血為自配。

1.2 方法

1.2.1 HEp-2-NS1細胞對6種常見呼吸道病毒的敏感性

1.2.1.1 接種病毒以1×105個/mL的接種濃度將HEp-2和HEp-2-NS1接種于96孔板，置37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h。吸棄培養(yǎng)基加入10倍梯度稀釋的多種常見呼吸道病毒，包括IFA、IFB、RSV、ADV、PIV1、PIV3，室溫3000 r/min離心60 min。RSV、ADV補加含4%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基100 μL/孔；IFA、IFB、PIV1/3補加含4 μg/mL TPCK DMEM培養(yǎng)基100 μL/孔；置于5%CO2、36℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)6～8 d。

1.2.1.2 血凝試驗在透明尖底板每孔加50 μL 0.75%新鮮豚鼠血，加入50 μL含IFA、IFB、PIV1/3病毒培養(yǎng)液，混勻，放入4℃冰箱30～60 min后觀察結(jié)果。細胞凝集孔底于一點為陰性，擴散于孔面則為陽性。

1.2.1.3 細胞病變效應(yīng)法檢測RSV、ADV病毒滴度每天觀察RSV、ADV細胞病變效應(yīng)（CPE），當與細胞對照相比，感染RSV病毒的單層細胞出現(xiàn)局部大而形態(tài)不規(guī)則的細胞融合，形成多核巨細胞時則判斷為CPE陽性。感染ADV病毒的單層細胞出現(xiàn)局部大而圓的固縮或致密的細胞，呈“葡萄樣”或“串珠狀”判斷為CPE陽性。根據(jù)CPE結(jié)果，用Reed-Muench法［5］計算病毒滴度，以50%細胞感染量（TCID50）表示。

1.2.2 HEp-2-NS1細胞分離培養(yǎng)RSV的臨床評價

使用深圳兒童醫(yī)院533份符合急性上呼吸道感染診斷的患兒咽拭子。96孔細胞板準備HEp-2-NS1和HEp-2細胞，置36℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d即長滿。咽拭子標本室溫解凍后震蕩20～30 s，棄去拭子，4℃3000 r/min離心5 min，取上清液接種細胞。每份標本接種上清液0.2 mL/孔，做復孔，以RSV標準株為陽性對照，同時設(shè)立陰性對照。經(jīng)室溫3000 r/min離心1 h后加入細胞維持培養(yǎng)基0.2 mL/孔，置36℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6 d。每天觀察CPE，當與陰性對照相比，培養(yǎng)物的單層細胞出現(xiàn)局部大而形態(tài)不規(guī)則的細胞融合，形成多核巨細胞時則判斷為RSV CPE陽性。登記CPE出現(xiàn)時間并拍照記錄。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HEp-2-NS1細胞對多種常見呼吸道病毒的敏感性

2.1.1 血凝試驗檢測HEp-2-NS1細胞對IFA堯IFB堯PIV1堯PIV3的敏感性

實驗結(jié)果顯示，IFA、IFB和PIV1、PIV3經(jīng)HEp-2細胞和HEp-2-NS1細胞擴增后，IFA、IFB滴度均為1∶8，PIV1和PIV3滴度均為1∶4。見圖1。 2.1.2細胞病變效應(yīng)法檢測HEp-2-NS1細胞對RSV和ADV的敏感性

2.1.2.1 病毒滴度RSV在HEp-2和HEp-2-NS1兩種細胞中培養(yǎng)第2天TCID50為（2.67±0.16）和（3.67± 0.20），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；第3天TCID50為（2.67±0.25）和（3.77±0.35），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；第4天TCID50為（4.50±0.16）和（4.67±0.26），差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；第5天病毒TCID50均為（5.30±0.21）。見圖2。

ADV在HEP-2和HEP-2-NS1兩種細胞中培養(yǎng)第2天TCID50為（2.67±0.18）和（3.00±0.49）；第3天TCID50為（2.67±0.18）和（3.30±0.49）；第4天TCID50為（3.00±0.24）和（3.33±0.33）；第5天TCID50為（3.00±0.13）和（3.33± 0.23）；差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。見圖2。

圖1 HEp-2-NS1細胞對4種呼吸道病毒的血凝試驗結(jié)果

圖2 細胞病變效應(yīng)法檢測RSV、ADV病毒滴度

圖3 HEp-2和HEp-2-NS1細胞對RSV、ADV病毒敏感性比較

2.1.2.2 細胞病變效應(yīng)結(jié)果感染RSV的HEp-2-NS1細胞培養(yǎng)2 d后出現(xiàn)局部范圍的細胞融合病變，病變范圍占全視野的30%，4 d后可在鏡下清楚觀察到大范圍的細胞融合病變，出現(xiàn)多個多核巨細胞，病變范圍約占全視野的95%。同時對比感染RSV的HEp-2細胞，培養(yǎng)2 d未發(fā)現(xiàn)CPE，培養(yǎng)4 d后出現(xiàn)多個小范圍細胞融合病變，病變范圍占全視野的45%。見圖3a～d。

感染ADV的HEp-2-NS1細胞培養(yǎng)2 d后出現(xiàn)局部腫脹的細胞，細胞間隙增大；培養(yǎng)4 d后可見大范圍細胞呈典型的葡萄串狀脫落，部分細胞溶解為碎片，病變范圍達全視野的95%。同時對比感染ADV的HEp-2細胞，培養(yǎng)2 d未發(fā)現(xiàn)CPE，培養(yǎng)4 d出現(xiàn)聚集、腫脹等細胞病變，病變范圍約占全視野的50%。感染ADV的HEp-2和HEp-2-NS1細胞培養(yǎng)4天，結(jié)果如圖3e～h。

2.2 HEp-2-NS1細胞分離培養(yǎng)RSV的臨床評價

利用533份上呼吸道感染患兒標本對HEp-2-NS1細胞進行臨床評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HEp-2-NS1和HEp-2兩種細胞對RSV的CPE初篩分離率分別為7.50%（39/533）和3.75%（20/533），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；CPE出現(xiàn)時間HEp-2-NS1為（3.77±0.90）d，而HEp-2為（4.66±0.80）d，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；HEp-2-NS1細胞感染臨床標本后產(chǎn)生RSV CPE的最早時間為48 h，比HEp-2提前24 h。

3 討論

轉(zhuǎn)基因技術(shù)早已用于科學研究，隨著病毒復制分子機制不斷地被揭示，發(fā)現(xiàn)了一些在病毒復制中起重要作用的基因調(diào)節(jié)因素，由此開發(fā)出一些基因工程細胞株。早于1988年研究人員已用改造過的CD4陽性淋巴細胞［6］和HeLa細胞［7］用于檢測人類免疫缺陷病毒，并將此技術(shù)成功應(yīng)用于臨床檢測單純皰疹1型和2型病毒（HSV1、HSV2）［8］。Lutz等［9］建立了一株293T轉(zhuǎn)基因細胞，最短能在感染病毒6 h后檢出甲型流感病毒，用于甲型流感病毒的鑒定以及判斷抗病毒藥物治療效果。目前國外已有商品化的MIX系列混合共培養(yǎng)細胞，用于檢測所有已知的可培養(yǎng)腸道病毒屬病毒［10-11］和呼吸道病毒［12-14］。Zhu等［15］成功構(gòu)建Vero-ICP0-Luc細胞株，用于抗皰疹病毒藥物的篩選和耐藥情況的評價［16］。這些轉(zhuǎn)基因細胞不但擴大了對病毒的易感譜，而且使檢測敏感性有所提高［17］。

本研究使用的HEp-2-NS1細胞由HEp-2細胞經(jīng)基因工程改造而成，既保留了原細胞對病毒敏感的基本特性［18-19］，又具有獨特的胞內(nèi)自發(fā)抗干擾素等性質(zhì)［4］。為了進一步考核其潛在的臨床應(yīng)用價值，本研究利用6種常見的呼吸道病毒株評價HEp-2-NS1細胞對不同病毒的敏感性。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，雖然HEp-2-NS1細胞不能提高對病毒株的敏感性或擴展病毒譜，但在同樣的感染滴度下，HEp-2-NS1對RSV和ADV的CPE產(chǎn)生范圍和數(shù)量均有提高，出現(xiàn)典型CPE的時間也顯著縮短。實驗證明，在病毒分離鑒定過程中使用HEp-2-NS1細胞可以有效地降低RSV、ADV的結(jié)果判讀難度和提高分離效率。

經(jīng)過系列的實驗室評價后，本研究使用533份兒科標本作臨床應(yīng)用評價。對于533份臨床標本，HEp-2-NS1細胞同樣表現(xiàn)出CPE典型、快速、容易判斷等特點。在相同的環(huán)境下由同一經(jīng)驗豐富實驗人員使用統(tǒng)一的操作步驟，HEp-2-NS1細胞的總體分離率比HEp-2細胞提高一倍，而且結(jié)果判斷時間提前24 h。從初篩結(jié)果可以看出HEp-2-NS1細胞大大提高了RSV病毒的分離效率，有望成為臨床RSV檢測的另一個實用工具。

綜上所述，新構(gòu)建的HEp-2-NS1細胞是一種新型的RSV鑒定細胞，解決了部分病毒分離工作中病毒敏感性不強、報告時間慢等理論和技術(shù)問題［20］，為臨床實驗室分離RSV提供了較為合適的細胞。

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Sensitivity analysis of 6 kinds of common resPiratory virus isolated from HEP-2-NS1 modified cell

QIN Sheng1WANG Yutao2MENG Shaowei1XU Zhenjie1GUAN Wenda2CHEN Cha1YANG Zifeng2JIANG Haiming3
1.Department of Laboratory Medicine，Guangdong Province Traditiona1 Chinese Medica1 Hospita1，Guangdong Province，Guangzhou510006，China；2.The First Affi1iated Hospita1 of Guangzhou Medica1 University State Key Laboratory of Respiratory Disease，Guangzhou Institute of Respiratory DiseaseNationa1 C1inica1 Research Center for Respiratory Disease，Guangdong Province，Guangzhou510230，China；3.Guangzhou Institute of Respiratory Disease Co.，Ltd.，Guangdong Province，Guangzhou510663，China

Objective To eva1uation of the effect of 6 common respiratory viruses iso1ated from HEp-2-NS1 modified ce11s.Methods HEp-2-NS1 modified ce11s were inocu1ated with 6 kinds of common respiratory virus，with the HEp-2 ce11s as the comparison，inc1uding inf1uenza A virus（IFA），inf1uenza B virus（IFB），adenovirus（ADV），respiratory syncytia1 virus（RSV）and parainf1uenza virus type 1 and 3（PIV1/3）.The vira1 titer and cytopathogenic effect（CPE）were detected by hemagg1utination test and CPE method.533 pharyngea1 swabs from chi1dren with acute upper respiratory tract infection were detected in HEp-2 and HEp-2-NS1 ce11 1ine.The RSV positive rate iso1ated from HEp-2-NS1 ce11s and CPE time were eva1uated.Results①Vira1 titer：hemagg1utination test showed that IFA and IFB vira1 titers in HEp-2-NS1 and HEp-2 ce11 1ines were both 1∶8 and PIV1，PIV3 vira1 titers were both 1∶4.CPE resu1ts showed the vira1 titers of RSV in HEp-2 andHEp-2-NS1 were（2.67±0.16）and（3.67±0.20）after 2 days cu1tured，with statistica11y significant difference（P＜0.05）；whi1e the vira1 titer of ADV after 3 days cu1tured were（2.67±0.18）and（3.33±0.49），there was no statistica11y significant difference（P＞0.05）.②CPE detection：compared to HEp-2 ce11，the RSV ce11 fusion in HEp-2-NS1 cou1d be observed after 2 days cu1tured，the extent of disease accounted for 30%of fu11 fie1d of vision；as we11 as 95%1esions in a wide range of RSV ce11 fusion cou1d be observed c1ear1y after 4 days cu1tured.③Eva1uation of c1inica1 specimen：the separation rate of RSV in c1inica1 pharyngea1 swab with HEp-2-NS1 and HEp-2 ce11s were 7.50%and 3.75%respective1y（P＜0.05）.The time of RSV CPE appeared in HEp-2-NS1 was（3.77±0.90）d，whereas HEp-2 was（4.66±0.80）d，with statistica11y significant difference（P＜0.05）.Conclusion HEp-2-NS1 ce11 is a new kind of too1 for RSV identification，which can quick1y iso1ated cu1ture RSV in c1inica1 1aboratory.

Virus cu1ture；HEp-2-NS1 ce11；Respiratory syncytia1 virus

R373.1

A

1673-7210（2016）07（c）-0029-05

2016-04-21本文編輯：程銘）

廣東省中醫(yī)藥局建設(shè)中醫(yī)藥強省科研課題（20152126）；廣東省省級科技項目（2013B020224006）；廣東省廣州市科技惠民項目（2014Y2-00031）。

秦笙（1983-），男，醫(yī)學碩士，主要從事臨床病毒學診斷研究。

關(guān)文達（1982-），男，醫(yī)學碩士，研究員，主要從事臨床病毒學研究。