王文革 李軍強 石 菲 李洪濤

1.蘭州軍區(qū)臨潼療養(yǎng)院附屬醫(yī)院普外科，陜西西安710600；2.蘭州軍區(qū)總院普外科，甘肅蘭州730050

上調(diào)Sema3A表達水平對結腸癌細胞侵襲、增殖能力的影響

王文革1李軍強1石 菲1李洪濤2

1.蘭州軍區(qū)臨潼療養(yǎng)院附屬醫(yī)院普外科，陜西西安710600；2.蘭州軍區(qū)總院普外科，甘肅蘭州730050

目的探索上調(diào)Sema3A表達水平對結腸癌細胞侵襲、增殖水平的影響。方法構建Sema3A正義表達載體，慢病毒包裝后感染人結腸癌SW620細胞，獲取穩(wěn)定過表達的Sema3A結腸癌細胞株。實驗同時設置空白對照組、陰性對照組。行Transwe11、MTT、克隆形成實驗探索過表達Sema3A對SW620生物學行為的影響。結果成功構建過表達Sema3A的人結腸癌SW620細胞株。與陰性對照組比較，Sema3A過表達細胞株的增殖速度減慢，克隆形成率下降，侵襲能力降低，差異均有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結論外源性上調(diào)Sema3A表達水平可降低SW620體外增殖、侵襲轉移能力，提示Sema3A對結腸癌生長、侵襲存在抑制作用。

Sema3A；結腸癌；增殖；侵襲

結腸癌（Co1orecta1 cancer，CRC）為最常見的消化道癌癥之一，發(fā)病率高居惡性腫瘤的第三位。西方國家結腸癌死亡率高居癌癥類疾病前三位［1］。隨著飲食結構變化，近年我國CRC發(fā)病和死亡人數(shù)逐年遞增［2］。從良性腺瘤或囊腫發(fā)展到晚期結腸癌、轉移瘤，包含了基因、蛋白質(zhì)水平的多重改變［3］。臂板蛋白3A抗體（Semaphorin3A，Sema3A）是導向蛋白Semaphorin家族中的重要分子之一［4］，其有拆解細胞骨架、纖絲狀肌動蛋白等功能［5-6］。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)Sema3A除了可以促進神經(jīng)元生長、再生，還能調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長、增殖水平［7］。在多種癌癥組織或細胞中，Sema3A均有不同程度的表達下調(diào)或缺失，從而抑制癌細胞的增殖、侵襲、轉移［8］。本研究旨在觀察Sema3A在結腸癌細胞侵襲、增殖中的作用，探索過表達Sema3A對結腸癌細胞的生物學行為的影響，揭示其抑制結腸癌增殖、侵襲的作用機制，為臨床研究提供相應試驗依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 儀器與試劑

人結腸癌細胞株SW620引自中科院上海細胞庫。慢病毒病毒載體（Lentivirus-Sema3A）、陰性對照載體（CON145）以及慢病毒包裝試劑盒（上海吉凱基因化學技術有限公司）。四季青胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司），胰酶（上?；瘜W試劑有限公司試劑一廠），熒光顯微鏡（日本O1ympus），CO2孵箱（日本Sanyo），生物安全柜（上海振梓創(chuàng)空氣凈化設備有限公司），RPMI 1640培養(yǎng)液（美國Gibco），Trizo1（美國Invitrogen），PCR引物、反轉錄試劑盒以及SYBR Green Rea1-time PCR Masker Mix試劑盒（日本TaKaRa），MTT（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司），E1x800酶標儀（美國BioTek），Giemsa染液ECM550（美國Chemicon），多聚甲醛［生工生物工程（上海）股份有限公司］，RnaseA ENO531（加拿大Fermentas），Transwe11小室（美國Corning），酶標儀（美國Thermo）。其余試劑為本實驗保存。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2、飽和濕度條件，在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)SW620，實驗細胞取對數(shù)生長周期細胞。

1.2.2 慢病毒載體構建上海吉凱基因化學技術有限公司構建過表達Sema3A慢病毒載體（Lentivirus-Sema3A），其表達綠色熒光蛋白（GFP）。胰酶消化SW620細胞后配制成細胞懸液，以數(shù)量約為5×105的細胞懸液接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，放置孵箱中待細胞融合度達30%，以細胞感染復數(shù)（MOI）值（MOI為20）加入相應量慢病毒。設置空白對照組（CON組）、陰性對照組（N1組，僅有GFP）、過表達Sema3A慢病毒細胞組（SE，攜帶Sema3A+GFP）。轉染16 h后換液。轉染72 h熒光拍照，以GFP觀察感染率，若熒光率＞80%收集細胞，提取RNA以進行Rea1-time PCR試驗。

1.2.3 Real-time PCR試驗用Trizo1等有機溶劑提取總RNA，進行RNA含量和質(zhì)量檢驗后，選擇純度較高的RNA用于后續(xù)實驗。首先將總RNA反轉錄為cDNA：37℃，15 min，反轉錄反應；85℃，5 s，反轉錄酶的失活反應。之后進行Rea1-time PCR試驗：95℃，5 s變性60℃，30 s退火延伸；共30個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參基因，Sema3A和β-actin引物序列由Takara公司設計合成。

1.2.4 SW620細胞轉染后生長曲線轉染96 h后胰酶消化細胞（CON、N1、SE），重懸行細胞計數(shù)后以2000 ce11s/we11轉種96孔板繼續(xù)培養(yǎng)，設1、2、3、4、5 d共5個檢測時間點，每個時間點設復孔5個。采用胎牛血清+無抗生素RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)至相應檢測點，行MTT實驗測細胞懸液吸光度值（490 nm）。以上實驗重復3次。

1.2.5 克隆形成實驗轉染4 d胰酶消化N1、SE組細胞，重懸行細胞計數(shù)后接種6孔培養(yǎng)板（800 ce11s/we11），加含10%DFBS的MEM培養(yǎng)液2 mL/we11，設復孔3個/組，培養(yǎng)7 d。換液、觀察細胞1次/3 d，熒光顯微鏡下拍照。PBS洗滌，加入多聚甲醛1 mL/we11固定1 h，磷酸鹽緩沖液洗滌細胞，Giemsa染色20 min，ddH2O洗滌后顯微鏡下觀察克隆形成情況，并拍照計數(shù)。

1.2.6 Transwell侵襲實驗轉染24 h后用胰酶處理N1、SE組，接種細胞于預包備Matrige1膠的Transwe11上室（其孔徑為8 μm）。分別加RPMI 1640培養(yǎng)液（1%胎牛血清）于上室以及含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液于下室，培養(yǎng)24 h。拭去Transwe11孔徑膜上細胞，用4%多聚甲醛固定膜下細胞，然后結晶紫染色細胞。熒光顯微鏡（100×）下觀察侵襲情況，并隨機選5個鏡下視野（100×）行細胞計數(shù)及拍照（200×）。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Sema3A表達載體的構建

Lentivirus-Sema3A慢病毒轉染72 h后于顯微鏡下觀察結腸癌細胞SW620，轉染效率約為80%，見圖1（封三）。采用Rea1 time-PCR檢測SE組SW620細胞中Sema3A mRNA水平高于N1組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。提示包裝Sema3A載體的慢病毒有效上調(diào)人結腸癌細胞SW620的Sema3A表達水平。

2.2 Sema3A過表達對SW620細胞生長、增殖能力的影響

MTT實驗顯示，轉染3、4、5 d時，病毒轉染的SE組的SW620細胞數(shù)目較CON組及N1組明顯減少，差異均有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；CON組細胞數(shù)目與N1組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。提示上調(diào)Sema3A表達后，人結腸癌細胞SW620增殖速度較前減慢。見圖3。

克隆形成實驗顯示，SE組的SW620細胞的克隆形成能力較N1組差，N1組克隆數(shù)為（273±6）個，SE組克隆數(shù)為（168±4）個，兩組比較差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖4。該結果與MTT結果一致，提示上調(diào)Sema3A表達后人結腸癌細胞SW620的生長、增殖受到抑制。

2.3 Sema3A過表達對SW620細胞侵襲能力的影響

細胞侵襲實驗提示，SE組SW620細胞的穿膜細胞數(shù)目較N1組減少，SE組細胞侵襲力為2.437± 0.123，N1組細胞侵襲力為5.231±0.231，兩組比較差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖5（封三）。

3 討論

作為軸突導向因子家族，Semaphorins起初的研究多集中于神經(jīng)系統(tǒng)。隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)該分子在腫瘤生長增殖、血管內(nèi)皮細胞遷移、免疫反應均有重要作用。Semaphorins通過促進或抑制血管生長而調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展。Semaphorins家族受體主要為Neuropi1ins以及P1exins，前者為Semaphorins蛋白結合位點，后者起到信號轉換功能［9］。Sema3A為NP-1激動劑，P1exin A為其中的信號轉換亞單元［10］。研究Sema3A激活的細胞靶點、受體結合位點，發(fā)現(xiàn)其具有提升趨藥性、引力、軸突/樹突生長發(fā)育等作用［11］。Tamagnone等［12］發(fā)現(xiàn)，Sema3A作用范圍不僅包括引導細胞移行、調(diào)控免疫功能，還調(diào)節(jié)血管生成、腫瘤增殖。Bagci等［13］的研究發(fā)現(xiàn)Sema3A通過調(diào)控底物黏附力而促進膠質(zhì)母細胞瘤的播散［13］。在2011年，B1anc等［14］的研究提示Semaphorins及其受體（p1exins及neuropi1ins）在前列腺癌組織中廣泛表達，且Sema3A在腫瘤組織中表達水平較正常組織高（P＜0.05）。同年，Staton等［15］研究提示：Sema3A低表達與乳腺導管癌的侵襲力密切相關。

大量研究提示Sema3A在腫瘤增殖中有抑制侵襲、轉移的作用［16］，故本研究構建Sema3A過表達載體，探索其是否影響結腸癌增殖、侵襲、轉移水平［17］。通過慢病毒載體轉染至人結腸癌細胞SW620中，設上調(diào)Sema3A表達組、空白對照組、陰性對照組，檢測并比較三組細胞中生長曲線、增殖、細胞侵襲力。實驗結果提示，Sema3A過表達載體成功構建：SE組Sema3A水平較N1組、CON組明顯升高；上調(diào)Sema3A表達水平后，SW620細胞生長、增殖、侵襲水平均較空白對照明顯下降。提示Sema3A極有可能通過下調(diào)結腸癌細胞的生長水平、增殖能力、侵襲力來抑制腫瘤增殖、轉移能力。高表達Sema3A與抑制結腸癌增殖、侵襲力密切相關，可納入腫瘤標志物候選項目。進一步探索Sema3A對結腸癌細胞作用的特異性受體及其下游信號分子可全面研究Sema3A抑制人結腸癌增殖、侵襲力的關鍵信號通路，為結腸癌臨床篩查、治療手段開辟新道路。

圖2 Real time-PCR檢測轉染后人結腸癌細胞SW620的Sema3A在RNA水平的表達

圖3 病毒轉染后SW620細胞生長曲線

圖4 病毒轉染后SW620細胞克隆形成數(shù)

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Effect of uP-regulating Sema3A on Proliferation and invasion of colorectal cancer cells

WANG Wenge1LI Junqiang1SHI Fei1LI Hongtao2
1.Department of Genera1 Surgery，the Affi1iated Hospita1 of Lintong Sanitarium of Mi1itary Area Command of Lanzhou，Shaanxi Province，Xi'an710600，China；2.Department of Genera1 Surgery，Genera1 Hospita1 of Mi1itary Area Command of Lanzhou，Gansu Province，Lanzhou730050，China

Objective To study the effect of up-regu1ating Sema3A on pro1iferation and invasion of co1orecta1 cancer ce11s.Methods The Sema3A sense expression vector was constructed.Then the SW620 ce11s of co1orecta1 cancer were infected using the 1enti-virus packaging to obtain the stab1e co1orecta1 cancer ce11 1ines with over-expressing of Sema3A.Whi1e the b1ank contro1 group and negative contro1 group were set up in this experiments.Transwe11 assays，MTT，and c1one formation assays were used to observe the effect of over-expression of Sema3A on the bio1ogica1 behavior of human co1orecta1 cancer ce11s SW620.Results Lenti-virus vector with over-expressing of Sema3A was successfu11y constructed.Compared with the negative contro1 group，over-expression of Sema3A reduced the pro1iferation，dec1ined the c1one formation rate and decreased the invasion of SW620 ce11s of co1orecta1 cancer，the differences were statistica11y significant（P＜0.01）.Conclusion Exogenous over-expression of Sema3A can decrease the metastasis abi1-ity of co1orecta1 cancer ce11s and inhibite their abi1ity of pro1iferation which suggests that Sema3A may p1ay an important ro1e in co1orecta1 cancer progression.

Sema3A；Co1orecta1 cancer；Pro1iferation；Invasion

R735.3

A

1673-7210（2016）07（c）-0013-04

2016-04-03本文編輯：任念）

國家自然科學基金青年基金資助項目（8130 1681）。

王文革（1966-），男，副主任醫(yī)師；研究方向：普外科。

李洪濤（1976.5-），男，副主任醫(yī)師；研究方向：胃腸疾病。