沈笑 韓旭 李先鋒 詹啟敏 童彤

1.國(guó)家癌癥中心北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院，北京100021；

2.中國(guó)科學(xué)院北京生命科學(xué)研究；，北京100101

人食管鱗癌中CCNYL1啟動(dòng)子區(qū)甲基化研究

沈笑1韓旭1李先鋒2詹啟敏1童彤1

1.國(guó)家癌癥中心北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院，北京100021；

2.中國(guó)科學(xué)院北京生命科學(xué)研究；，北京100101

目的篩選在食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）發(fā)病過(guò)程中異常甲基化基因，為治療提供潛在靶咖。方法采用簡(jiǎn)化的、具有代表性的DNA甲基化測(cè)序（RRBS）及基因表達(dá)譜芯片分析7例ESCC患者癌組織及其癌旁DNA甲基化水平和mRNA表達(dá)水平。將甲基化差異基因及表達(dá)差異基因用DAVID工具進(jìn)行功能富集分析，篩出甲基化與表達(dá)負(fù)相關(guān)基因。對(duì)候選基因進(jìn)行硫化測(cè)序PCR（BSP）驗(yàn)證獲得DMR序列，采用QUMA分析軟件對(duì)17對(duì)癌和癌旁甲基化差異測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，并對(duì)其DMR單個(gè)CpG位咖的甲基化水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。最后采用實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)候選基因表達(dá)水平。結(jié)果RRBS測(cè)序得到癌和癌旁差異甲基化區(qū)基因共5268個(gè)，其中689個(gè)差異甲基化區(qū)位于Promoter及CDS上。這些富集得到15條顯著信號(hào)通路，包括Notch信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路及黏著斑信號(hào)通路等腫瘤中常見(jiàn)信號(hào)通路。結(jié)合7例ESCC組織表達(dá)譜芯片，篩選出啟動(dòng)子區(qū)高甲基化且表達(dá)降低基因Cyclin Y-like 1（CCNYL1），在17對(duì)ESCC組織中用BSP驗(yàn)證，CCNYL1基因DMR處CpG位咖13、CpG位咖16、CpG位咖17、CpG位咖18和CpG位咖19呈現(xiàn)高甲基化。此外，在10對(duì)冰凍ESCC組織中進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果與RRBS測(cè)序和表達(dá)譜芯片一致，在ESCC中CCNYL1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平整體高于癌旁組織，并且表達(dá)水平低于癌旁組織。結(jié)論CCNYL1基因甲基化水平可能作為ESCC生物標(biāo)志物。

DNA甲基化；差異甲基化區(qū)；食管鱗狀細(xì)胞癌；CCNYL1

癌癥的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)很復(fù)雜的過(guò)程，受遺傳、環(huán)境等多因素影響，其中表觀遺傳修飾改變?nèi)鏒NA甲基化在癌癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［1-2］。食管癌作為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，根據(jù)病因?qū)W和病理學(xué)特征，可分為兩種類(lèi)型：食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）［3］。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，食管癌在腫瘤中死亡率排第6位，5年生存率為9%～40%［4-5］。據(jù)2011年國(guó)家癌癥中心統(tǒng)計(jì)，我國(guó)食管癌發(fā)病率排第6位，男女死亡率均排第4位［6］，在我國(guó)主要以ESCC為主。近年來(lái)，用高通量分析方法研究DNA甲基化水平成為食管癌研究熱咖，本實(shí)驗(yàn)旨在篩選ESCC DNA甲基化差異基因，研究其差異甲基化水平，尋找ESCC中潛在生物標(biāo)志物。

1 料與方法

1.1 材料

本研究所用組織樣本分別來(lái)自：汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院李恩民教授惠贈(zèng)的冰凍ESCC組織樣本7例，其中，男6例，年齡大于60歲患者5例，用于高通量測(cè)序分析；國(guó)家癌癥中心北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院病理科提供ESCC石蠟包埋組織10例，其中，男8例，年齡大于60歲患者5例，用于檢測(cè)DNA甲基化水平；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腔鏡科王貴齊主任提供的冰凍ESCC組織10例，其中，男9例，年齡大于60歲患者5例，用于檢測(cè)RNA表達(dá)水平。所有癌旁組織均取自距腫瘤組織5 cm，樣本均選自術(shù)前無(wú)放療化療患者，病理診斷均為ESCC，都處于T3期無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且樣本收集時(shí)均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 高通量測(cè)序分析

采用簡(jiǎn)化的、具有代表性的DNA甲基化測(cè)序（RRBS）［7］及基因表達(dá)譜芯片（由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院程書(shū)鈞課題組設(shè)計(jì)）對(duì)7例冰凍ESCC患者的癌組織及其配對(duì)癌旁進(jìn)行高通量分析。分析其DNA甲基化水平和RNA表達(dá)水平，并獲得甲基化圖譜和表達(dá)圖譜。將甲基化差異基因用DAVID工具進(jìn)行功能富集分析，從中篩選DNA甲基化與RNA表達(dá)負(fù)相關(guān)的基因進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.2 硫化測(cè)序分析

采用重亞硫酸鹽測(cè)序PCR（bisulfite sequencing PCR，BSP）方法［8］對(duì)7例冰凍ESCC及10例石蠟包埋ESCC組織進(jìn)行DNA甲基化驗(yàn)證性研究。

1.2.2.1 DNA提取與DNA硫化提取ESCC及配對(duì)癌旁的全基因組DNA（天根組織細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒），檢測(cè)DNA濃度。用DNA甲基化試劑盒（ZYMO RESEARCH），DNA硫化量750 ng，反應(yīng)條件為98℃10min，64℃2.5 h，然后將DNA洗脫保存。

1.2.2.2 巢式PCR引物設(shè)計(jì)使用在線工具M(jìn)ethprimer，CCNYL1啟動(dòng)子區(qū)引物分別為Nest1上游引物：5'-GGGTTTTTGATTATGATGATTAG-3'，下游引物：5'-AAACTTCCAAATTTCTCTTCTTATA-3'；Nest2上游引物：5'-TTTTGATTATGATGATTAGAAAATAA-3'，下游引物：5'-AACACTATATACCAAACAATATTCC-3'。PCR反應(yīng)根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，反應(yīng)體系為20μL。Nest1產(chǎn)物稀釋100倍作為Nest2的反應(yīng)模板。

1.2.2.3 PCR產(chǎn)物驗(yàn)證及瓊脂糖凝膠回收后連接及轉(zhuǎn)化PCR反應(yīng)后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，在紫外顯像儀下觀察凝膠電泳結(jié)果，切取預(yù)期擴(kuò)增片段，根據(jù)天根生化科技有限公司提供的DNA純化回收試劑盒進(jìn)行回收。連接載體為pEASYR-Blunt Zero載體（北京全式金生物有限公司）。該載體是一種高效PCR產(chǎn)物連接的專(zhuān)用T載體，通過(guò)自殺基因表達(dá)與否篩選陽(yáng)性重組子。轉(zhuǎn)化后37℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)，每樣本挑取10個(gè)陽(yáng)性單克隆振蕩培養(yǎng)。

1.2.3 BSP測(cè)序分析

將單克隆菌液進(jìn)行Sanger測(cè)序，由立菲生物技術(shù)有限公司合成引物及測(cè)序。采用QUMA分析工具對(duì)CCNYL1基因單克隆測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。分析候選區(qū)域整體甲基化水平及單個(gè)CpG位咖甲基化水平。

1.2.4 芯片結(jié)果驗(yàn)證

將冰凍組織加入Trizol Reagent并用研磨棒研磨至充分裂解，提取總RNA。用Promega試劑盒將2μg的總RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA，接著進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。引物采用Oligo7軟件設(shè)計(jì)，上游引為5'-ACATTTGTCCCACCAACTGGAA-3'，下游引物為5'-GAAGAAGCTCCAGAAAATGCCTT-3'，擴(kuò)增片段為165 bp。反應(yīng)根據(jù)SYBR-Green方法（TAKARA）進(jìn)行半定量，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)經(jīng)提取后運(yùn)用GeneSpring GX 12.0（美國(guó)Agilent公司）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用X2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 果

2.1 高通量測(cè)序分析圖譜

將7例冰凍癌和癌旁組織進(jìn)行CpG甲基化聚類(lèi)分析（圖1A），癌和癌旁CpG甲基化具有較好聚類(lèi)。經(jīng)芯片表達(dá)譜檢測(cè)癌及癌旁組織中總mRNA表達(dá)譜差異（圖1B），獲得表達(dá)差異顯著的基因1210個(gè)（P≤0.005，F(xiàn)C≥4.0），其中，表達(dá)下調(diào)955個(gè)，表達(dá)上調(diào)255個(gè)。

圖1 高通量測(cè)序分析圖譜

2.2 差異基因功能富集

7例冰凍ESCC樣本經(jīng)RRBS測(cè)序得到癌和癌旁DNA甲基化顯著差異基因5268個(gè)，其中689個(gè)差異甲基化區(qū)位于Promoter及CDS上。將差異基因用DAVID工具進(jìn)行功能富集分析，獲得15條差異信號(hào)通路，包括Notch信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路及黏著斑信號(hào)通路等腫瘤中常見(jiàn)信號(hào)通路。見(jiàn)表1。

2.3 RRBS測(cè)序與芯片表達(dá)譜關(guān)聯(lián)分析

將甲基化差異基因與表達(dá)差異基因相關(guān)聯(lián)，獲得負(fù)相關(guān)基因共82個(gè)（圖2A，封三），異常甲基化在啟動(dòng)子區(qū)有29個(gè)，其中，CCNYL1甲基化水平差異顯著，在癌癥數(shù)據(jù)庫(kù)中（http：//www.cbioportal.org/），CCNYL1基因在EAC中有缺失也有擴(kuò)增，而在ESCC中未發(fā)現(xiàn)異常改變，結(jié)合CCNYL1單個(gè)DMR甲基化分布（圖2B，封三），紅色（虛線上部分）代表在ESCC中甲基化水平，綠色（虛線下部分）代表在癌旁中甲基化水平，可看出CCNYL1的啟動(dòng)子區(qū)在ESCC中呈現(xiàn)高甲基化。

表1 甲基化差異基因信號(hào)通路

2.4 BSP驗(yàn)證結(jié)果

2.4.1 CCNYL1基因DMRPCR擴(kuò)增

ESCC與配對(duì)癌旁組織基因組DNA提取后，經(jīng)重亞硫酸氫鈉修飾后做模板進(jìn)行CCNYL1基因巢式PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增序列包含DMR，按照擴(kuò)增序列給CpG編序，DMR包含從CpG13到CpG19。見(jiàn)圖3。

2.4.2 CCNYL1基因DMR處單個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化程度

在線軟件QUMA分析CCNYL1基因甲基化程度，圖4表示癌旁和癌組織CCNYL1基因在170個(gè)陽(yáng)性單克隆中CpG位咖甲基化程度。柱形圖表示，CCNYL1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG位咖甲基化與未甲基化差異。經(jīng)X2檢驗(yàn)，DMR處CpG位咖13、CpG位咖16、CpG位咖17、CpG位咖18、CpG位咖19在ESCC中呈現(xiàn)高甲基化（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

2.5 CCNYL1基因DMR整體甲基化狀態(tài)分析

CCNYL1基因DMR CpG位咖整體甲基化狀態(tài)為癌旁組織甲基化率為52.8%，癌組織甲基化率為73.3%，經(jīng)X2檢驗(yàn)差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表3。

2.6 CCNYL1基因表達(dá)水平

在10例冰凍ESCC組織中提取總RNA，并用Real-time PCR檢測(cè)CCNYL1表達(dá)水平，結(jié)果顯示，CCNYL1溶解曲線特異性較好，在9例冰凍ESCC組織中表達(dá)顯著降低。見(jiàn)圖5。

3 論

CCNYL1為最新識(shí)別的Cyclin家族一員，蛋白序列與Cyclin Y（CCNY）高度相似，然而，其功能在不同組織中沒(méi)有明確特征，主要起到蛋白激酶連接作用［9］。最新研究顯示，CCNYL1與CDK相互作用調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路影響雄鼠精子形成，敲除CCNYL1基因小鼠CCNYL1（-/-）可導(dǎo)致雄性小鼠不育，而"生型雄鼠無(wú)此現(xiàn)象［10］。前期，筆者對(duì)7例ESCC組織樣本RRBS測(cè)序及表達(dá)譜檢測(cè)［11］，RRBS可單堿基分辨率所需數(shù)據(jù)量小，能覆蓋到啟動(dòng)子區(qū)域中＜20%的CpG位咖［7，12］。經(jīng)分析獲得差異甲基化區(qū)位于啟動(dòng)子區(qū)并與表達(dá)譜芯片結(jié)果相關(guān)聯(lián)得到顯著一致基因29個(gè)。在甲基化差異顯著基因中，已有報(bào)道PRSS3在非小細(xì)胞肺癌中高甲基化導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖［13］；在EAC中，其激活PAR-2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖［14］。PSCA在結(jié)腸癌、胃癌、前列腺癌和膀胱癌等中都有研究［15-17］。為了研究ESCC發(fā)生過(guò)程中DNA甲基化水平的改變，結(jié)合癌癥數(shù)據(jù)庫(kù)及功能分析，從中篩選出甲基化升高并且表達(dá)降低基因CCNYL1，其在ESCC中未有突變、缺失和擴(kuò)增等改變。

圖3 IGV中CCNYL1基因及其DMR

圖4 QUMA分析癌旁和癌組CCNYL1基因啟動(dòng)子區(qū)DMR處各CpG位點(diǎn)甲基化率

表2 CCNYL1啟動(dòng)子區(qū)DMR處各CpG位點(diǎn)平均甲基化百分率的X2檢驗(yàn)

表3 CCNYL1基因DMR CpG位點(diǎn)整體甲基化水平［n（%）］

圖5 CCNYL1基因表達(dá)水平

為驗(yàn)證ESCC中CCNYL1甲基化與測(cè)序結(jié)果一致，進(jìn)一步采用BSP方法檢測(cè)ESCC組織中CCNYL1的甲基化情況。BSP是一種靈敏的能直接檢測(cè)分析基因組DNA甲基化模式的方法。重亞硫酸鹽處理后，PCR產(chǎn)物中原先非甲基化的胞嘧啶位咖被胸腺嘧啶所替代，而甲基化的胞嘧啶位咖保持不變。通過(guò)這個(gè)方法能得到特定位咖在各個(gè)基因組DNA分子中的甲基化狀態(tài)［7，18］。BSP實(shí)驗(yàn)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致，CCNYL1啟動(dòng)子區(qū)DMR在ESCC組織中發(fā)生高甲基化。用Real-time PCR檢測(cè)10例ESCC及癌旁組織CCNYL1基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其在ESCC中表達(dá)降低，與芯片結(jié)果一致。CCNYL1基因啟動(dòng)子區(qū)在ESCC中異常甲基化，可能為ESCC潛在生物標(biāo)志。

脊椎動(dòng)物中甲基化修飾有兩種形式：一種分散于DNA中，另一種是CpG位咖高度聚集在一起，稱(chēng)CpG島（CGIs）。絕大多數(shù)CGI與管家基因相關(guān)，余下的CGIs則與組織特異性基因的啟動(dòng)子區(qū)相關(guān)［19］。本研究中，對(duì)20例ESCC組織中CCNYL1啟動(dòng)子區(qū)21個(gè)CpG位咖進(jìn)行甲基化分析，經(jīng)統(tǒng)計(jì)，ESCC中DMR區(qū)CpG位咖13、CpG位咖16、CpG位咖17、CpG位咖18、CpG位咖19呈現(xiàn)高甲基化。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ESCC甲基化異常基因CCNYL1，盡管其功能研究較少，但其啟動(dòng)子區(qū)甲基化改變可為ESCC發(fā)病機(jī)制提供新的理論基礎(chǔ)，對(duì)于食管癌在臨床上的診治有著潛在應(yīng)用價(jià)值［20］。

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Study on CCNYL1 promoter methylation in hum an esophageal squam ous cell carcinom a

SHEN Xiao1HAN Xu1LIXianfeng2ZHANQimin1TONG Tong1
1.National Cancer Center，Cancer Hospital，Peking Union Medical College Chinese Academy of Medical Sciences，
Beijing 100021，China；2.Beijing Institutes of Life Science，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101，China

Objective To screen candidate genes to characterize the alterations of DNA methylation in esophageal squamous cell carcinoma（ESCC），in order to provide targets for cancer therapy.M ethods Genome-scaled DNA methylation and mRNA expression profiles between 7 ESCCs and their adjacent normal tissues were analyzed by reduced representation bisulfite sequencing（RRBS）and digital gene expression profiling.After analyzing the annotation and pathways of these differential genes by DAVID tool，screened the genes which had a negative correlation between methylation and expression.Bisulfite sequencing PCR（BSP）was used to obtain the DMR sequence of these candidate genes.Then QUMA software was used to analyze the methylation difference between 17 pairs of carcinoma and adjacent normal tissues.Finally，real-time reverse transcription PCR（RT-PCR）was used tomeasure the expression of these candidate genes.Results RRBS indicated many differentiallymethylated regions（DMRs）in 5628 genes，ofwhich 689 genes were differentially methylated in Promoter and CDS regions.These genes were included in 15 signaling pathways，such as Notch signaling pathway，Wnt signaling pathway and Focal adhesion，which were the common pathways in cancer.Combined analysis with the result of gene arrays，candidate gene Cyclin Y-like 1（CCNYL1）was screened，with hyper-methylation in its promoter region and decreased expression in carcinoma gene expression profiling.CCNYL1 gene was characterized by using BSP in 17 pairs of tissues from ESCC，according to statistical analysis，in DMR，CpG site 13，CpG site 16，CpG site 17，CpG site 18 and CpG site 19 were hyper-methylation in ESCC patients.Besides，another 10 pairs of tissueswere detected by RT-PCR.The consequences showed that CCNYL1 gene was hyper-methylation in promoter and decreased expression in ESCCs，which were consistent with RRBS analysisand gene expression profiling results.Conclusion The methylation status of CCNYL1 can be used as a potential ESCC biomarker.

DNA methylation；Differentiallymethylated regions；Esophageal squamous cell carcinoma；CCNYL1

R735.1

A

1673-7210（2016）05（c）-0004-05

2016-02-21本文編輯：程銘）

國(guó)家重大科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2013CB910703）。

沈笑（1989.9-），女，國(guó)家癌癥中心北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所2013級(jí)細(xì)胞生物學(xué)專(zhuān)業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：人類(lèi)食管癌中DNA甲基化。

童彤（1969.01-），女，研究員，碩士生導(dǎo)師；研究方向：人類(lèi)食管癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制研究。