郭慧

江西省宜春市婦幼保健；藥劑科，江西宜春336000

雷公藤內(nèi)酯醇對卵巢癌SKOV-3細胞株惡性生物學行為影響的實驗研究

郭慧

江西省宜春市婦幼保??；藥劑科，江西宜春336000

目的研究雷公藤內(nèi)酯醇（TP）對卵巢癌SKOV-3細胞株惡性生物學行為的影響。方法培養(yǎng)卵巢癌SKOV-3細胞株，用0、10、20、40、80 nmol/L的TP處理，0 nmol/L TP處理的為正常對照（NC）組，10、20、40、80 nmol/L TP處理的為10 nmol/L TP組、20 nmol/L TP組、40 nmol/L TP組、80 nmol/L TP組，測定細胞活力及細胞Bcl-2、Bax、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1的mRNA含量。結(jié)果TP處理能以劑量依賴性和時間依賴性的方式降低卵巢癌細胞活力，同組不同時間點及同時間點多組間的細胞活力比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。10、20、40、80 nmol/L TP組細胞Bcl-2mRNA含量（0.83±0.11、0.68±0.07、0.54±0.08、0.33±0.04）均低于NC組（1.00±0.15），BaxmRNA含量（1.32±0.15、1.66±0.21、2.19±0.35、3.22±0.63）均高于NC組（1.00±0.13），Beclin-1 mRNA含量（1.44±0.18、1.76± 0.24、2.51±0.32、3.10±0.47）均高于NC組（1.00±0.18），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ（1.33±0.19、1.81±0.22、2.49±0.31、3.41±0.51）均高于NC組（1.00±0.17），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。不同劑量TP組Bcl-2、Bax、Beclin-1mRNA含量及LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論TP能夠通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax表達、細胞自噬的途徑來抑制卵巢癌SKOV-3細胞株的增殖。

卵巢癌；雷公藤內(nèi)酯醇；增殖；自噬

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，早期缺乏典型的臨床癥狀，確診時多數(shù)已發(fā)展至中晚期，預后情況較差、5年存活率不足30%。卵巢癌的死亡率位居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的前列，是威脅女性生命健康的重要疾病?；熓桥R床上治療晚期卵巢癌的常用方法，但是受到化療藥物不良反應(yīng)、耐藥性等因素制＜，整體的化療效果并不理想［1-2］。近年來，臨床學者致力于探尋更加低毒性、高殺傷性的藥物來治療卵巢癌。雷公藤內(nèi)酯醇（triptolide，TP）是從中藥材雷公藤中分離得到的二萜內(nèi)酯類化合物，對子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤的生長均有抑制作用［3-4］。但是，關(guān)于單獨應(yīng)用TP是否能影響卵巢癌細胞的惡性生物學行為尚未見報道，本研究主要分析TP對卵巢癌SKOV-3細胞株惡性生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

卵巢癌SKOV-3細胞株購于中科；細胞庫，RPMI1640培養(yǎng)基、牛血清均購于Gibco公司，TP購于Sigma公司，MTS細胞活力檢測試劑盒購于Promega公司，PCR試劑盒購于北京天根公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)SKOV-3細胞株復蘇后用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞生長至70%～80%的密度后用0.125%的胰酶進行消化，取消化后的細胞并重懸，接種在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中，培養(yǎng)瓶中的細胞用于繼續(xù)傳代，培養(yǎng)板中的細胞用于藥物處理。

1.2.2 細胞處理取培養(yǎng)板中的細胞，待細胞密度生長至80%左右，將含有血清的培養(yǎng)基更換為不含血清的培養(yǎng)基，24 h后在細胞孔內(nèi)加入不同劑量的TP，培養(yǎng)孔內(nèi)的藥物終濃度分別為0、10、20、40、80 nmol/L。0 nmol/L TP處理的為正常對照（NC）組，不同劑量TP處理的為10 nmol/L TP組、20 nmol/L TP組、40 nmol/L TP組、80 nmol/L TP組。連續(xù)處理不同時間后進行后續(xù)檢測。每批細胞重復5次。

1.2.3 細胞活力檢測檢測細胞活力時，細胞接種在96孔細胞板中，藥物處理12、24、48 h，分別在培養(yǎng)基中加入20μLMTS檢測試劑，繼續(xù)孵育4 h后，在酶標儀上測定450 nm處的吸光度（OD）值。

1.2.4 mRNA含量測定檢測細胞中mRNA含量時，細胞接種在12孔細胞板中，藥物處理24 h后，棄盡培養(yǎng)基，采用RNA提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行實驗操作，得到mRNA所對應(yīng)的cDNA樣本；取cDNA樣本并進行稀釋，然后采用PCR試劑盒配置反應(yīng)體系，具體體系如下：cDNA樣本1μL、Mastermix反應(yīng)液10μL、20μmol/L的上下游引物各0.4μL、去離子水8.2μL。按照下列程序進行PCR反應(yīng)：95℃、15 s，特異性退火溫度、20 s，72℃、25 s，重復40個循環(huán)，計算機自動生成擴增曲線及對應(yīng)的起跳循環(huán)數(shù)（Ct值），通過2-ΔΔCt公式計算mRNA含量。擴增的基因包括Bcl-2、Bax、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin-1以及β-actin。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析和處理，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組計量資料比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時間點細胞活力比較

TP處理24 h的半最大效應(yīng)濃度（EC50）為36.8 nmol/L，處理48 h的EC50為13.5 nmol/L。同時間點多組間比較：處理后12、24、48 h，TP組細胞OD值均顯著低于NC組，且TP劑量越大，細胞OD值越低；同組不同時間點比較：TP組細胞處理后12、24、48 h的OD值有差異，處理時間越長，細胞OD值越低。見表1。

表1 各組不同時間點細胞活力比較（x±s）

2.2 各組細胞Bcl-2、Baxm RNA含量比較

處理后24 h，TP組細胞Bcl-2 mRNA含量顯著低于NC組，BaxmRNA含量顯著高于NC組，且TP劑量越大，細胞Bcl-2mRNA含量越低、Bax mRNA含量越高。見表2。

表2 各組細胞Bcl-2、Baxm RNA含量比較（x±s）

2.3 各組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1mRNA含量比較

處理后24 h，TP組細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 mRNA含量均顯著高于NC組；TP劑量越大，細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 mRNA含量越高。見表3。

表3 各組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1m RNA含量比較（x±s）

3 討論

化療是目前臨床上治療晚期卵巢癌的主要方法，配合以放療能夠在一定程度上延長患者的生存時間，但是整體預后并不理想，5年生存率也較低［5-7］。癌細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性是造成卵巢癌化療效果不佳的主要原因［8-9］，探尋更為有效的卵巢癌化療藥物一直是臨床學者研究的熱點。雷公藤是臨床上用于抗炎、抗腫瘤、兔疫調(diào)節(jié)等治療的中藥材，TP是從雷公藤中分離得到的二萜內(nèi)酯類化合物，也是雷公藤的有效成分。已有離體研究證實，TP對子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌等惡性腫瘤細胞的增殖具有抑制效應(yīng)，能夠造成DNA斷裂、染色質(zhì)凝集以及凋亡小體形成［3-4］。

近年來，有國內(nèi)學者報道了TP聯(lián)用紫杉醇、順鉑等化療藥物對卵巢癌細胞的體外活性具有抑制作用［10-11］，但是關(guān)于TP單藥處理對卵巢癌細胞的影響尚未見報道。本研究根據(jù)前期預實驗結(jié)果選擇10、20、40、80 nmol/L的TP來處理體外培養(yǎng)的卵巢癌細胞，通過測定細胞活力可知，TP能以劑量依賴性和時間依賴性的方式降低卵巢癌細胞的活力。由此初步證實，TP對卵巢癌細胞的增殖具有抑制效應(yīng)，推測其具備用于卵巢癌治療的潛在價值。

線粒體凋亡途徑是調(diào)節(jié)細胞活力的重要機制，Bcl-2家族是介導線粒體凋亡途徑的主要分子［12-13］。Bax是Bcl-2家族中的促凋亡分子，能與線粒體膜結(jié)合并形成滲透性膜轉(zhuǎn)移孔復合物，調(diào)節(jié)線粒體膜轉(zhuǎn)換孔的開放和關(guān)閉，誘導線粒體釋放細胞色素C并通過下游Caspase家族來造成細胞凋亡［14-15］；Bcl-2是Bcl-2家族中的抗凋亡分子，能與Bax形成異源二聚體，拮抗Bax誘導線粒體細胞色素C釋放的作用，從而抑制下游Caspase分子的活化及其所介導的細胞凋亡［16］。在使用TP處理后24 h檢測，TP能減少Bcl-2的mRNA含量，增加Bax的mRNA含量，且藥物劑量越大，細胞Bcl-2的mRNA含量越低、Bax的mRNA含量越高。這說明TP能通過Bcl-2/Bax所介導的線粒體凋亡途徑來調(diào)節(jié)卵巢癌的活力。

自噬是近年來新發(fā)現(xiàn)的細胞凋亡機制，又稱為Ⅱ型程序性死亡，指細胞通過溶酶體降解自身受損細胞器及異常大分子物質(zhì)的過程［17-18］。在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中，自噬過程顯著受到抑制，無法清除體內(nèi)異常增殖的腫瘤細胞，從而造成腫瘤發(fā)生和發(fā)展［19］。LC3是公認的自噬標志分子，在自噬處于低水平時，非活化狀態(tài)的LC3-Ⅰ表達量高于活化狀態(tài)的LC3-Ⅱ；自噬被激活時，LC3-Ⅱ的表達顯著上調(diào)、LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ的比例增加［20-21］。同時，在自噬激活及自噬體形成的過程中，自噬相關(guān)基因ATG-6的同源基因Beclin-1高表達發(fā)揮了至關(guān)重要的作用［20，22-23］。TP處理后的細胞自噬水平測定結(jié)果顯示，TP能夠顯著增加細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例、Beclin-1含量，且TP劑量越大，細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例、Beclin-1含量越高。這說明自噬是TP調(diào)節(jié)卵巢癌細胞活力的另一個途徑。

綜上所述，TP能夠通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax表達、細胞自噬的途徑來抑制卵巢癌SKOV-3細胞株的增殖。

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Experimental study on the effect of triptolide on m alignant biological behavior of ovarian cancer cell line SKOV-3

GUOHui
Department of Pharmacy，Maternal and Child Health Hospital of Yichun City，Jiangxi Province，Yichun 336000，China

Objective To study the effect of triptolide（TP）onmalignant biological behavior of ovarian cancer cell line SKOV-3.M ethods Ovarian cancer SKOV-3 cellswere cultured，treated with 0，10，20，40，80 nmol/L TP and 0 nmol/L TP treatmentwas NC group，10，20，40，80 nmol/L TP treatmetwas 10 nmol/L TP group，20 nmol/L TP group，40 nmol/L TP group，80 nmol/L TP group respectively.Cell viability and mRNA contents of Bcl-2，Bax，LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ，Beclin-1 were determined.Resu lts TP decreased cell viability of ovarian cancer cell on dose dependent and time dependentmanner，there were significant differences on cell viability in different time points the same group and the same time point between groups（P＜0.05）.Bcl-2mRNA contents（0.83±0.11，0.68±0.07，0.54±0.08，0.33±0.04）of 10 nmol/L TP group，20 nmol/L TP group，40 nmol/L TP group，80 nmol/L TP group were lower than that of NC group（1.00± 0.15）；BaxmRNA contents（1.32±0.15，1.66±0.21，2.19±0.35，3.22±0.63）of 10 nmol/L TP group，20 nmol/L TP group，40 nmol/L TP group，80 nmol/L TP group were higher than that of NC group（1.00±0.13）；Beclin-1 mRNA contents（1.44±0.18，1.76±0.24，2.51±0.32，3.10±0.47）of10 nmol/L TP group，20 nmol/L TP group，40 nmol/L TPgroup，80 nmol/L TP group were higher than that of NC group（1.00±0.18）；LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ（1.33±0.19，1.81±0.22，2.49±0.31，3.41± 0.51）of 10 nmol/L TP group，20 nmol/L TP group，40 nmol/L TP group，80 nmol/L TP group were higher than that of NC group（1.00±0.17），with statistical differences（P＜0.05）.Bcl-2，Bax，Beclin-1mRNA contents and LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰin different doses of TP group were compared，with statistical differences（P＜0.05）.Conclusion TP can inhibit the proliferation of ovarian cancer cell line SKOV-3 through regulating the expression of Bcl-2/Bax and cell autophagy.

Ovarian cancer；Triptolide；Proliferation；Autophagy

R737.31

A

1673-7210（2016）05（a）-0024-04

2016-01-16本文編輯：李亞聰）