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        重癥監(jiān)護(hù)病房醫(yī)院感染耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌耐藥基因的研究與分析

        2016-11-22 01:36:21李凌竹冷應(yīng)蓉查筑紅程永素羅光英江銀輝貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院感染管理科貴州貴陽550004
        關(guān)鍵詞:耐藥醫(yī)院

        陳 璐,李凌竹,冷應(yīng)蓉,查筑紅,程永素,黃 冰,羅光英,王 敏,江銀輝(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院感染管理科,貴州貴陽 550004)

        重癥監(jiān)護(hù)病房醫(yī)院感染耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌耐藥基因的研究與分析

        陳璐,李凌竹,冷應(yīng)蓉,查筑紅,程永素,黃冰,羅光英,王敏,江銀輝(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院感染管理科,貴州貴陽 550004)

        目的:通過分析菌株耐藥性和耐藥基因檢出情況,了解我院醫(yī)院感染耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌(carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii,CRAB)的流行病學(xué)特點,并探討耐藥機制,為臨床合理選藥提供參考。方法:篩選重癥監(jiān)護(hù)病房醫(yī)院感染患者送檢標(biāo)本分離的CRAB,采用PCR擴增技術(shù)檢測菌株是否攜帶OXA-23、TEM、SHV、VEB、CARB、DHA、VIM、IMP、PER、aac(3)-I、aac(6')-Ib、aph(3')-I、armA、sul1和sul2基因。結(jié)果:53株醫(yī)院感染CRAB對復(fù)方新諾明、妥布霉素較敏感,對其余13種抗菌藥物耐藥率均達(dá)50%以上,基因檢出率依次為:TEM 100%,OXA-23 96.23%,armA 90.57%,aac(6')-Ib 22.64%,aac(3)-I 26.42%,aph(3')-I 73.58%,sul1 30.19%,sul2 56.60%,SHV 3.77%,VEB、CARB、DHA、IMP、VIM、PER未檢出。共14組耐藥基因檢出與耐藥情況完全相同的菌株。結(jié)論:我院醫(yī)院感染CRAB的患者仍可考慮選用復(fù)方新諾明和妥布霉素進(jìn)行治療。我院定居并繁殖的CRAB耐β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的機制可能與TEM酶密切相關(guān),攜帶OXA-23基因可能是耐碳青霉烯類抗菌藥物的重要因素,檢出率低的耐藥基因可能在耐β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物機制中的作用不大。我院不僅存在科室內(nèi)部的交叉感染,而且存在科室之間的交叉感染,應(yīng)加大力度做好感染控制工作。

        耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌;耐藥;耐藥基因;醫(yī)院感染

        鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)已成為我國院內(nèi)感染的主要致病菌之一,2014年中國CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示,我國17所教學(xué)醫(yī)院鮑曼不動桿菌占臨床分離革蘭陰性菌的14.23%,僅次于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌[1]。廣譜抗菌藥物的大量運用使鮑曼不動桿菌耐藥形勢嚴(yán)峻,耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌(carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii,CRAB)的比例逐年增高,細(xì)菌對碳青霉烯類耐藥即意味著對其他抗菌藥物基本耐藥[2]。重癥監(jiān)護(hù)病房收治的患者免疫力低下、侵入性操作多,并長期使用各類廣譜抗菌藥物,感染CRAB的患者較多見。本研究重點考察重癥監(jiān)護(hù)病房醫(yī)院感染患者所分離CRAB的耐藥性,初步了解我院醫(yī)院感染CRAB的流行病學(xué)特點,并探討耐藥性與耐藥基因的關(guān)聯(lián)性,以期為分子生物學(xué)研究及臨床合理用藥提供理論參考。

        1 材料和方法

        1.1菌株來源

        53株CRAB分離源自2014年1月– 2015年5月貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)醫(yī)院感染患者不同來源的標(biāo)本(剔除同一患者同部位的重復(fù)標(biāo)本)。醫(yī)院感染判斷標(biāo)準(zhǔn)遵循《醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)》并結(jié)合臨床實際情況。

        1.2細(xì)菌分離鑒定及藥敏試驗

        采用美國德靈Microscan WalkAway 4.0系統(tǒng)對病原菌進(jìn)行鑒定及藥敏試驗。質(zhì)控菌株標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)AE ATCC 27853購自貴州省臨床檢驗中心。藥敏紙片購自英國Oxoid公司。檢測菌株對阿米卡星、頭孢他啶、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢吡肟、慶大霉素、左氧氟沙星、美羅培南、哌拉西林、頭孢哌酮/舒巴坦、復(fù)方新諾明、替卡西林/克拉維酸、四環(huán)素、妥布霉素的敏感性。結(jié)果判定依據(jù)臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)制定的標(biāo)準(zhǔn)。

        1.3細(xì)菌處理

        挑純培養(yǎng)菌,取1 mL細(xì)菌LB培養(yǎng)液于1.5 mL離心管內(nèi),離心(12 000 r·min-1)1 min去上清,用1 mL無菌蒸餾水重新懸浮細(xì)菌沉淀,離心(12 000 r·min-1)1 min去上清,加蛋白酶K(200 ng·mL-1)溶液500 μL,56 ℃水浴2 h,然后于沸水中水浴10 min,離心(12 000 r·min-1)1 min,取上清液即為基因檢測的模板液,于– 20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.4基因檢測

        采用PCR法檢測15個耐藥基因,PCR儀為ABI2700型。引物序列根據(jù)數(shù)據(jù)庫NCBI(www.ncbi. nlm.nih.gov/nucleotide)各基因序列完成設(shè)計,靶基因序列登錄號、引物序列及目的產(chǎn)物長度見表1。各反應(yīng)體系為20 μL:上下游引物各l μL(10 μmol·L-1),dNTP 2 μL (2 mmol·L-1),10倍PCR緩沖液(含Mg2+)2 μL,TaqDNA 聚合酶1 U(不計體積),超純水12 μL,模板液2 μL。PCR擴增熱循環(huán)參數(shù)為:95 ℃預(yù)變性3 min,然后95 ℃ 30 s →55 ℃ ~ 62 ℃(根據(jù)引物的退火溫度)30 s → 72 ℃ 60 s,循環(huán)33個周期,最后72 ℃延長5 min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)為英國Syngene公司的 G-BOX。

        2 結(jié)果

        2.1一般情況

        53株CRAB中,急診ICU 11株,綜合ICU 26株,內(nèi)科ICU 9株,神經(jīng)ICU 6株,兒科ICU 1株;男性35株(66.04%),女性18株(33.96%)。詳見表2。

        表1 耐藥基因PCR引物序列[3]Tab 1 PCR primer sequence of drug-resistant genes[3]

        表2 CRAB的分類檢出情況Tab 2 The classification about the detection of CRAB

        2.2耐藥情況分布

        本研究檢測了53株醫(yī)院感染CRAB對15種抗菌藥物的耐藥情況,詳見表3。

        表3 53株醫(yī)院感染CRAB的藥敏特點分布情況Tab 3 Distribution of the drug-sensitive characteristics of 53 strains of nosocomial acquired CRAB

        2.3耐藥基因檢測情況分布

        對妥布霉素敏感的16株CRAB,氨基糖苷類修飾酶基因檢出:armA(81.25%,13/16),aph(3')-I(75.00%,12/16),aac(3)-I(6.25%,1/16),aac(6')-Ib(0/16)。對復(fù)方新諾明敏感的33株CRAB,磺胺耐藥基因檢出:sul1(9.09%,3/33),sul2(48.48%,16/33)。詳見表4。

        表4 53株醫(yī)院感染CRAB的耐藥基因檢測分布情況Tab 4 Distribution of the detection results of drug-resistant genes of 53 strains nosocomial acquired CRAB

        2.4耐藥基因檢出與耐藥情況對比研究

        共14組(每組2株細(xì)菌)耐藥基因檢出與耐藥情況完全相同的菌株,其中綜合ICU 9組、神經(jīng)ICU 2組、急診ICU 2組和內(nèi)科ICU 1組。14組CRAB中,住院日期無交叉的有內(nèi)科ICU組(16號2014-03-28入院,2014-05-14出院;37號2014-06-01入院,2014-07-07出院);綜合ICU組(17號2014-04-23入院,2014-07-31出院;81號2015-01-02入院,2015-01-31出院;88號2015-01-16入院,2015-04-13出院;92號2014-10-22入院,2014-11-03出院)。不同ICU耐藥基因檢出與耐藥情況完全相同的菌株排列詳見表5。

        3 討論

        綜上,本研究結(jié)果提示,男性感染CRAB多于女性。鮑曼不動桿菌院內(nèi)感染最常見的部位是肺部,是醫(yī)院獲得性肺炎尤其是呼吸機相關(guān)性肺炎重要的致病菌[4],CRAB多分離自痰標(biāo)本,考慮與重癥監(jiān)護(hù)病房患者多使用呼吸機相關(guān)。60歲以上老年人送檢痰標(biāo)本分離率最高,分析原因是由于老年患者呼吸器官退化,呼吸功能及咳嗽反射減弱,肺組織彈性減弱等導(dǎo)致排痰功能降低,更易在醫(yī)院內(nèi)感染CRAB引起肺炎。

        本研究結(jié)果表明,CRAB除對復(fù)方新諾明、妥布霉素較敏感外,對其余13種抗菌藥物耐藥率均達(dá)50%以上(見表3),耐藥形勢嚴(yán)峻。本院獲得的CRAB仍可考慮選用復(fù)方新諾明和妥布霉素進(jìn)行治療,與湖北黃石、蘇州、廣東省中山市的報道結(jié)果并不一致[5-7]。產(chǎn)生抗菌藥物滅活酶是鮑曼不動桿菌耐藥的重要機制[2],產(chǎn)酶與攜帶耐藥基因相關(guān)。53株CRAB對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物均耐藥,同時所有菌株均攜帶TEM基因,故我院定居并繁殖的CRAB耐β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的機制可能與TEM酶密切相關(guān)。有研究[8]曾證明OXA-23型碳青霉烯酶在鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類耐藥中起著重要作用。攜帶OXA-23基因可能是本院鮑曼不動桿菌耐碳青霉烯類抗菌藥物的重要因素。SHV檢出低,VEB、CARB、DHA、IMP、VIM、PER均未檢出,檢出率低的耐藥基因可能在本院分離CRAB耐β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物機制中的作用不大。研究氨基糖苷類修飾酶基因和磺胺耐藥基因發(fā)現(xiàn),對妥布霉素敏感的CRAB高檢出armA、aph(3')-I,低檢出aac(3)-I、aac(6')-Ib,對復(fù)方新諾明敏感的CRAB高檢出sul2,低檢出sul1,其關(guān)聯(lián)性有待進(jìn)一步探討。

        表5 各ICU耐藥基因和藥敏特點相同的菌株分布情況Tab 5 Distribution of the same drug resistance gene and drug sensitive characteristics of strains in each ICU department

        考慮耐藥情況和耐藥基因檢出完全一致的菌株可能具有同源性,提示我院不僅存在科室內(nèi)部的交叉感染,且存在科室間的交叉感染,尤其是內(nèi)科ICU和綜合ICU存在長期定植菌,說明臨床的清潔消毒工作不徹底,科室之間傳播的流行病學(xué)特點值得深入研究。

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        The study and analysis of drug resistance genes of nosocomial infection CRAB in ICU

        CHEN Lu,LI Ling-zhu,LENG Ying-rong,ZHA Zhu-hong,CHENG Yong-su,HUANG Bing,LUO Guang-ying,WANG Min,JIANG Yin-hui(The Infection Control Section of Guizhou Medical University,Guiyang 550004,China)

        Objective: To analyze the situation of antimicrobial resistance,related resistance genes and possible mechanism,and provide references for rational antimicrobial application and discover the epidemiological characteristics of CRAB in our hospital. Methods: PCR techniques were used to test OXA-23,TEM,SHV,VEB,CARB,DHA,VIM,IMP,PER,aac(3)-I,aac(6')-Ib,aph(3')-I,armA,sul1 and sul2 genes. Results: In addition to SMZ-TMP and tobramycin,resistant rate to 13 antibiotics were all over 50%. The detection rate of gene were TEM 100%,OXA-23 96.23%,armA 90.57%,aac(6')-Ib 22.64%,aac(3)-I 26.42%,aph(3')-I 73.58%,sul1 30.19%,sul2 56.60% and SHV 3.77%. VEB,CARB,DHA,IMP,VIM and PER were not detected. There were 14 bacterial groups which had the same drug resistance and drug resistance gene. Conclusion: SMZ-TMP and tobramycin can be used to cure the CRAB infected patients. The TEM gene may be closely related to β-lactams resistance. The OXA-23 may be a crucial factor for carbapenems resistance. Those genes with low detection rate may not play a big role in drug resistant mechanism. There are cross infection in the same department and among departments in our hospital,infection control should be strengthened.

        Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii; Drug resistance; Drug resistance gene; Nosocomial infection

        R978.1

        A

        1672 - 8157(2016)01 - 0052 - 04

        貴州省科技計劃項目(黔科合SY字2013-3176號)

        冷應(yīng)蓉,女,主任技師,主要從事醫(yī)院感染管理。E-mail:49728467@qq.com

        陳璐,女,主治醫(yī)師,主要從事病原菌耐藥機制研究。E-mail:49728467@qq.com

        (2015-10-11

        2015-12-16)

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