馬　萍，李志韌，雷　寧，曹　淼，張智杰，劉麗宏，周湘艷，辛艷茹（.火箭軍總醫(yī)院藥劑科，北京 00088；.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所，北京 00088）

·實(shí)驗(yàn)研究·

排氚片的利尿作用及急性毒性研究

馬萍1，李志韌1，雷寧1，曹淼1，張智杰1，劉麗宏1，周湘艷2，辛艷茹1（1.火箭軍總醫(yī)院藥劑科，北京 100088；2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所，北京 100088）

目的：探討排氚片的利尿作用，并進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)研究，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。方法：采用大鼠代謝籠法測(cè)量給藥后各組大鼠的排尿量，低、中、高3個(gè)劑量組的灌胃給藥量分別為4.8、9.6、19.2 g生藥·kg-1，評(píng)價(jià)排氚片利尿作用；采用小鼠4 h內(nèi)灌胃2次，給藥后連續(xù)觀察2周，觀察小鼠對(duì)排氚片的最大耐受劑量。結(jié)果：大鼠給藥后1 ～ 2 h和2 ～ 3 h，中、高劑量組的排尿量顯著高于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）；給藥后1 ～ 3 h，低、中、高3個(gè)劑量組的利尿作用強(qiáng)度分別相當(dāng)于空白對(duì)照的130.0%、140.0%和155.7%，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）；小鼠未出現(xiàn)嚴(yán)重的毒性反應(yīng)和死亡。結(jié)論：排氚片對(duì)大鼠有一定的利尿作用，其有效劑量為9.6 g生藥·kg-1，相當(dāng)于成人擬用劑量的15倍。小鼠4 h內(nèi)2次給藥的最大耐受劑量（MTD）大于333.8 g生藥·kg-1，相當(dāng)于臨床一日擬用量的521.6倍。

排氚片；利尿作用；急性毒性試驗(yàn)

排氚片為第二炮兵總醫(yī)院多年的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由黃芪、茯苓、桂枝、白術(shù)、澤瀉、豬苓、桔梗等組成，具有補(bǔ)肺健脾、通陽(yáng)益腎、利尿滲濕、排氚解毒的功效，用于人體感受氚輻射后的排氚治療。目前課題組已完成了排氚片的藥學(xué)研究[1-2]、藥效學(xué)和毒理學(xué)研究，進(jìn)行了軍隊(duì)特需藥品的申報(bào)，并已獲得總后軍特藥臨床研究的批準(zhǔn)（批件號(hào)2009JTL002）。排氚片是通過(guò)利尿作用而起到排氚的功效，本文詳述了其利尿作用的藥效學(xué)試驗(yàn)研究，及其臨床前安全性評(píng)價(jià)的急性毒性試驗(yàn)研究，為排氚片的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1藥物與試劑

排氚片（本院自制，批號(hào)041222）；氫氯噻嗪（天津力生制藥股份有限公司，批號(hào)040526）；氯化鈉（分析純，北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號(hào)981023）。

1.2動(dòng)物

選用ICR小鼠，雌雄各半，6周齡，體質(zhì)量18 ～ 20 g；健康的SD雄性大鼠，體質(zhì)量150 ～ 158 g，均由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2002-0001，使用許可證號(hào)：SYXK（京）2002-0002。動(dòng)物室符合國(guó)家二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，合格證號(hào)：SYXK（京）2002-002。飼養(yǎng)室溫度（22±2） ℃，濕度（60±5）%。由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供大小鼠飼養(yǎng)用的塊料[京動(dòng)（2000）第015號(hào)]。

1.3儀器

大鼠代謝籠、移液管、刻度離心管、灌胃針管。

2　方法

2.1對(duì)大鼠利尿作用的實(shí)驗(yàn)[3-6]

SD雄性大鼠預(yù)先置于代謝籠中1 d適應(yīng)環(huán)境。禁食不禁水18 h，按體質(zhì)量每100 g灌胃去離子水2.2 mL，灌胃前輕壓大鼠下腹部，排盡余尿。在每個(gè)代謝籠中放置1只大鼠，收集2 h尿液，凡排尿量超過(guò)給水量40%者用作正式利尿試驗(yàn)。篩選動(dòng)物60只，53只合格，合格率為88.3%。將篩選出的大鼠隨機(jī)分成5組，分別為空白對(duì)照組（1%鹽水）、陽(yáng)性對(duì)照氫氯噻嗪組（10 mg·kg-1）以及低、中、高3個(gè)劑量排氚片組（4.8、9.6、19.2 g生藥·kg-1），每組10只大鼠。試驗(yàn)前禁食不禁水18 h，試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)輕壓動(dòng)物下腹部，排盡余尿，空白對(duì)照組每100 g灌胃37 ℃ 1%鹽水5 mL，將試驗(yàn)用藥物溶于等量的1%鹽水中灌胃。在每個(gè)代謝籠中放置2只大鼠，給藥后每隔1 h收集尿液一次，連續(xù)收集6 h，并記錄各時(shí)間點(diǎn)收集的排尿量。

2.2急性毒性實(shí)驗(yàn)[7-8,3]

取ICR小鼠24只，雌雄各半，給藥前禁食14 h，不禁水，每只小鼠灌胃26.7 g干膏·kg-1（相當(dāng)于166.9 g生藥·kg-1），每10 g體質(zhì)量灌胃0.4 mL，4 h后重復(fù)灌胃一次，連續(xù)觀察14 d。給藥后，立即觀察動(dòng)物的反應(yīng)及死亡情況，第2天開(kāi)始，每天觀察一次。記錄動(dòng)物的外觀、行為活動(dòng)、精神狀態(tài)、食欲飲水、大小便及顏色、皮毛、膚色、呼吸、有無(wú)分泌物、體質(zhì)量變化等。

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析[9]

計(jì)算一定時(shí)間排尿量的平均值及其標(biāo)準(zhǔn)差，顯著性測(cè)定采用t檢驗(yàn)。

3　結(jié)果

3.1對(duì)大鼠排尿的影響

大鼠灌胃氫氯噻嗪后1 ～ 2 h和2 ～ 3 h排尿量顯著多于空白對(duì)照組（P ＜ 0.001）。大鼠灌胃排氚片后1 ～ 2 h和2 ～ 3 h排尿量也明顯多于空白對(duì)照組，隨著給藥劑量的增加大鼠排尿量有增加的趨勢(shì)，其中高劑量組和中劑量組的排尿量高于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05），詳見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，給藥后排尿量的增加主要集中在第1 ～ 2 小時(shí)和第2 ～ 3 小時(shí)。將給藥后大鼠1 ～ 3 h的排尿量合并后列于表2，結(jié)果表明，以空白對(duì)照組的排尿量為100%，則排氚片低、中、高3個(gè)劑量組的利尿作用強(qiáng)度分別為130.0%、140.0%和155.7%，與空白對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。

表1　給藥后不同時(shí)間段大鼠的排尿量分布情況Tab 1　Distribution of the rat urine output at different times after administration

表2　給藥后1 ～ 3 h內(nèi)大鼠的排尿量分布情況Tab 2　Distribution of the rat urine output during 1 - 3 h after administration

3.2急性毒性實(shí)驗(yàn)

因?yàn)轭A(yù)試驗(yàn)和正式試驗(yàn)的方法一致，所以將資料合并分析。 給藥后24只雌雄各半的小鼠中幾乎所有的小鼠立即出現(xiàn)行動(dòng)遲緩，眼無(wú)神，迷眼，多半小鼠出現(xiàn)呼吸急促，其中部分小鼠出現(xiàn)稀便，見(jiàn)表3。給藥后20 ～ 30 min，24只雌雄各半的小鼠癥狀緩解，小鼠開(kāi)始正?；顒?dòng)，攝食。14 d內(nèi)未觀察到小鼠死亡，體質(zhì)量均有增加，見(jiàn)表4。

表3　給小鼠灌胃排氚片后的癥狀表現(xiàn)Tab 3　The symptoms in mice with the intragastric administration of Paichuan tablets

表4　給小鼠灌胃排氚片后的體質(zhì)量變化Tab 4　The weight changes in mice with the intragastric administration of Paichuan tablets

4　討論

4.1排氚片功效的中醫(yī)理論基礎(chǔ)

氚毒主要通過(guò)污染肌膚或誤吸、誤飲，致使氚毒由肌膚、氣道、食道侵入機(jī)體，傷及臟腑，多損及肺、脾、腎三臟，故治療氚中毒主要在于調(diào)補(bǔ)肺、脾、腎三臟的氣化功能，通調(diào)水道，排氚解毒。課題組在中醫(yī)名方五苓散的基礎(chǔ)上完成排氚片的組方，五苓散出自《傷寒論》71條“太陽(yáng)病、發(fā)汗后，大汗出……若脈浮，小便不利，微熱消渴者，五苓散主之”[10]，排氚片方中黃芪，既可上補(bǔ)肺氣、下輸膀胱，又可中健脾氣、以運(yùn)化水濕達(dá)到排氚解毒的主要目的，故為君藥。方中白術(shù)和茯苓健脾益氣、淡滲利濕、利尿排氚，輔助君藥增強(qiáng)調(diào)補(bǔ)脾腎、排氚解毒之功，故為臣藥。方中豬苓、澤瀉和桂枝三藥合用，溫腎陽(yáng)、助氣化、通膀胱、排氚毒，共為佐藥。方中桔梗，開(kāi)提肺氣、通調(diào)水道、下輸膀胱，升清降濁，佐助君藥利尿排氚，故為使藥。

4.2排氚片的利尿作用

排氚片中君藥黃芪具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、利水消腫等功能主治[11]，有學(xué)者對(duì)黃芪藥材利尿作用的譜效關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)研究[12]。方中茯苓、豬苓和澤瀉是常見(jiàn)的中藥利尿藥，有學(xué)者通過(guò)綜述，分析討論了其活性成分及利尿作用機(jī)制[13]。本文通過(guò)藥效學(xué)試驗(yàn)也表明，中藥排氚片對(duì)大鼠有明顯的利尿作用，其有效劑量為9.6 g生藥·kg-1，相當(dāng)于成人擬用劑量的15倍。

4.3排氚片的臨床前安全性的初步評(píng)價(jià)

在急性毒性的預(yù)試驗(yàn)中，將每克受試藥加水至1.5 mL，給每只小鼠灌胃0.4 mL·10g-1體質(zhì)量，未觀察到小鼠出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)和死亡，主要癥狀為活動(dòng)遲緩，部分小鼠拉稀便，且30 min后恢復(fù)正常。為了觀察小鼠對(duì)排氚片的耐受情況，4 h后又重復(fù)給藥一次。第2次給藥后小鼠的反應(yīng)同第一次給藥?？紤]到再增加給藥量有困難，因此對(duì)本試藥進(jìn)行小鼠最大耐受劑量（MTD）測(cè)定。一天內(nèi)間隔4 h給小鼠2次受試藥，總劑量為333.8 g生藥·kg-1。給藥后連續(xù)觀察2周，小鼠未出現(xiàn)嚴(yán)重的毒性反應(yīng)和死亡。給藥后小鼠立即出現(xiàn)一過(guò)性的癥狀可能是由于灌藥的機(jī)械刺激造成的胃腸不適。小鼠對(duì)排氚片一日2次給藥的MTD大于333.8 g生藥·kg-1，相當(dāng)于臨床一日擬用量的521.6倍。

[1] 馬萍，李志韌，雷寧，等.HPLC-ELSD法測(cè)定排氚片中黃芪甲苷的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2014，30（5）：447-448.

[2] 辛艷茹，劉麗宏，馬萍，等.排氚片對(duì)小鼠體內(nèi)氚的促排作用[J].武警后勤學(xué)院學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2013，22（9）：773-776.

[3] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥政管理局.中藥新藥研究指南（藥學(xué)藥理學(xué) 毒理學(xué)）[G].北京：中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥政管理局，1994：60-64，202-204.

[4] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥政管理局.新藥（西藥）研究指導(dǎo)原則匯編（藥學(xué) 藥理學(xué) 毒理學(xué)）[G].北京：中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥政管理局，1993：121-124.

[5] 徐淑云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：987.

[6] 陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1993：356-362.

[7] 衛(wèi)生部新藥審評(píng)辦公室.新藥審批辦法及有關(guān)法規(guī)匯編[G].1992.

[8] 袁伯俊，王治喬.新藥臨床前安全性評(píng)價(jià)與實(shí)踐[M].北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，1997：23-42.

[9] 上海第一醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研組.醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979：32-33.

[10] 儲(chǔ)生康.五苓散臨床應(yīng)用體會(huì)[J].中醫(yī)藥臨床雜志，2015，27（4）：561-562.

[11] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：303.

[12] 劉小花，藺興遙，梁瑾，等.黃芪藥材利尿作用的譜效關(guān)系研究[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2013，30（5）：491-495.

[13] 趙宇輝，唐丹丹，陳丹倩，等.利尿藥茯苓、茯苓皮、豬苓和澤瀉的化學(xué)成分及其利尿作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2014，28（4）：594-599.

Study on the diuretic effects and acute toxicity of the Paichuan tablets

MA Ping1,LI Zhi-ren1,LEI Ning1,CAO Miao1,ZHANG Zhi-jie1,LIU Li-hong1,ZHOU Xiang-yan2,XIN Yan-ru1(1. Department of Pharmacy,General Hospital of the Rocket Forces,Beijing 100088,China; 2. National Institute for Radiological Protection,Chinese Center for Disease Control and Prevention,Beijing 100088,China)

Objective: To study the diuretic effect and acute toxicity of Paichuan tablets,in order to offer references for its clinical application. Methods: Metabolic cage method of rats was used to measure urine volume after the treatment. The rats were divided into low,medium and high three dose groups. The amounts of intragastric administration dose for each group were 4.8,9.6,19.2 g·kg-1in crude drug,respectively. The rats were given twice dose in 4 hours each day and continuously observed for two weeks to find out the maximum tolerated dosage of Paichuan tablets.Results: The amount of urine volume in medium and high dose groups were significantly higher than the blank control group in 1 – 2 h or 2 – 3 h (P ＜ 0.05). The urine volume showed that the diuretic effect intensity in the low,medium and high dose group was 130.0%,140.0% and 155.7% compared with the blank control group. The differences among each groups were statistically significant (P ＜ 0.05). No severe toxicity response and death were observed. Conclusion: Paichuan tablets has diuretic effect. The effective dose is 9.6 g·kg-1in crude drug,which is 15 times of the adult planning dose. The maximum tolerated dose (MTD) is greater than 333.8 g·kg-1in crude drug for 4 hours twice dose regimen,which is 521.6 times of the clinical planning daily dose.

Paichuan tablets; Diuretic effect; Acute toxicity test

R917

A

1672 - 8157(2016)01 - 0014 - 03

國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2009ZXJ09001-022）

辛艷茹，女，主任藥師，主要從事醫(yī)院藥學(xué)管理工作。E-mail：xinyanru@sina.cn

馬萍，女，副主任藥師，主要從事軍特藥及醫(yī)院新制劑的研發(fā)。E-mail：maping691009@126.com

（2015-08-10

2015-11-19）