姚毅，許亮清，姜青龍，藍(lán)嵐

（南昌市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江西南昌330006）

鄱陽湖土鯰人工繁殖及其胚胎發(fā)育情況

姚毅，許亮清，姜青龍，藍(lán)嵐

（南昌市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江西南昌330006）

鄱陽湖土鯰（Silirus asotus Linnaeus）是江西省鄱陽湖流域本地鯰魚（俗稱土鯰）。采用人工授精方式進(jìn)行鄱陽湖土鯰人工繁殖，在18℃～26℃的水溫條件下對鄱陽湖土鯰胚胎靜止水體中發(fā)育過程進(jìn)行了詳細(xì)的觀察記錄，胎發(fā)育經(jīng)過7個時期，從受精卵到孵化出膜約為47.08小時。并將觀察結(jié)果與南方大口鯰、瓦氏黃顙魚靜止水體胚胎發(fā)育時間進(jìn)行了比較。對比發(fā)現(xiàn)南方大口鯰孵化時間最短，其次為鄱陽湖土鯰，用時最長的為瓦氏黃顙魚。

鄱陽湖土鯰；人工受精；胚胎發(fā)育觀察

對特定水產(chǎn)品種進(jìn)行人工繁殖生產(chǎn)是水生資源保護(hù)的一種重要手段。通過對鄱陽湖土鯰繁殖生物學(xué)開展了相關(guān)研究，可以有效保護(hù)鄱陽湖土鯰野生種質(zhì)資源，并向漁業(yè)生產(chǎn)部門提供優(yōu)質(zhì)苗種。并為今后鄱陽湖土鯰的種質(zhì)資源保護(hù)，選育，與資源合理開發(fā)利用等工作的開展提供了必要的基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1　材料

1.1親本來源與培育

后備親本為2015年1月下旬捕撈自鄱陽湖區(qū)近西南水域的野生個體，共計472余尾，雄魚103尾、體重為160克～420克，雌魚369尾、體重為370克～770克。親本暫養(yǎng)于1332平主米、水深1.8米土池后進(jìn)行3個多月強化培育。

5月11日，將后備親本雌雄分離后移至孵化方池。人工催產(chǎn)前先行分辨后備親本中的雌雄個體，區(qū)別后再挑選發(fā)育程度好的作為此次試驗用親本。鄱陽湖土鯰雌雄同年發(fā)育成熟個體中，雄性個體體型相對偏瘦長，個體較小。鄱陽湖土鯰成熟雄性親本與雌性親本在身體外形上易分辨的特征為尾鰭末端的開叉深度以及開叉的個數(shù)。雄性親本尾鰭叉深度較大，長度達(dá)到整個尾鰭長度的70%左右，且只有一條尾鰭開叉；而雌性親本尾鰭開叉深度一般只有30%～50%左右，且在尾鰭部開有多條尾鰭叉。鄱陽湖土鯰通體無鱗片，通過對500組雌雄親本檢測未發(fā)現(xiàn)生殖錐星的情況，性成熟階段的雌雄個體體表為墨褐色，雄性個體在性成熟階段沒有出現(xiàn)明顯的生殖色。通過擠壓檢測雌性鯰魚腹部，挑選卵巢發(fā)育良好腹部膨大的雌性個體，并輕輕擠壓泄殖孔，有綠色卵粒被擠出。雄性個體生殖孔紅腫凸起，經(jīng)過擠壓可見有少量乳白色精液被擠出。

1.2藥物

此次試驗使用的人工催產(chǎn)藥物為：促黃體素釋放激素A3（LRH-A3）、絨毛膜促性腺激素（HCG），0.3%胰蛋白酶脫膜用途，丁香油混合液（丁香油：酒精=1∶5）。

2　方法

2.1人工催產(chǎn)

漁用催產(chǎn)劑的使用要依據(jù)后備親本性腺實際發(fā)育情況進(jìn)行選擇，此次試驗經(jīng)過觀察后備親本性腺發(fā)育情況，選配人工催產(chǎn)劑LRH-A3+HCG這兩種催產(chǎn)劑配合使用。催產(chǎn)劑使用前用0.7%生理鹽水稀釋溶解。采取一針注射法進(jìn)行肌注。雌魚注射劑量依據(jù)體重選取注射劑量為（LRH-A3 6ug+HCG 500IU）/公斤，雄魚劑量減半的多個劑量方案實施人工催產(chǎn)。注射部位為胸鰭基部。注射時用干毛巾包裹魚體以便于順利完成操作。并將親本放置與產(chǎn)卵池中網(wǎng)箱內(nèi)，產(chǎn)卵池內(nèi)每間隔1小時沖水10分鐘，多次升降水位，對親本施以環(huán)境刺激。

2.2人工授精和孵化

對親本進(jìn)行人工催產(chǎn)后，采用半濕法進(jìn)行人工授精獲得授精卵，并將授精卵平鋪在正方形孵化網(wǎng)布盤上。

3　胚胎發(fā)育觀察流程設(shè)計

人工授精5分鐘后，采集受精卵后使用0.3%胰蛋白酶液浸泡受精卵10分鐘后，除去受精卵外層膠膜，并用蒸餾水沖洗。每種孵化方式下每次隨機取30粒受精卵進(jìn)行胚胎發(fā)育觀察，使用鳳凰XTL-165-VT90體式顯微鏡進(jìn)行觀察，采用鳳凰光學(xué)顯微鏡高清攝像頭MC-D800U（C）選取胚胎發(fā)育期內(nèi)典型個體進(jìn)行拍照。胚胎發(fā)育分期劃分以超過半數(shù)被觀察樣本達(dá)到該時期的時間點作為確認(rèn)時間（殷名稱1991）。鄱陽湖土鯰受精卵早期發(fā)育快，采取每隔15分鐘觀察一次，待胚胎進(jìn)入原腸胚期后，再采用每隔25分鐘觀察一次。在幼體出膜后，為消除被觀察樣本胚體扭動對觀察記錄的不利影響，將被觀察樣本置于0.01%丁香油混合水溶液中進(jìn)行麻醉處理。

4　試驗條件

該次試驗使用了南昌市農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)過改造后的向塘良種繁殖場。

4.1水源和過濾設(shè)備

水源使用的是南昌第二干渠內(nèi)水源和輔助配備良種繁殖場內(nèi)淺表層地下井水。用于試驗用水都經(jīng)過過濾設(shè)備并經(jīng)100目篩絹網(wǎng)過濾后使用。

4.2苗種培育池

苗種培育池為長度為9米、寬度為7.5米、池深為1.25米的水泥池質(zhì)育苗池，育苗池池頂部位置布設(shè)有進(jìn)水管路，并且開設(shè)有排污口及其排水管路。

5　結(jié)果和討論

5.1受精卵

鄱陽湖土鯰受精卵體為草綠色，受精卵為近似圓球型，受精卵卵徑平均為1.62±0.15毫米（n=30），吸水膨脹10分鐘后卵徑為4.81±0.76毫米（n=30），并產(chǎn)生較強粘性，受精卵體具有較強的彈性，受精分鐘后，原生質(zhì)向動物極匯集，并在受精（45分鐘）后上端隆起為圓包狀胚盤。

5.2卵裂階段

受精卵經(jīng)（1小時30分鐘）后，隆起的圓包狀胚盤從中部開始凹陷，經(jīng)過緩慢下陷加深后，形成二個邊界為圓弧狀近長方形分裂球細(xì)胞；（1小時50分鐘）開始第二次分裂，發(fā)生位置與第一次形成分裂下陷處形成垂直線，分裂凹陷后形成4個形狀相似的外緣為90度扇形的分裂球細(xì)胞；（2小時05分鐘）開始第三次分裂，兩處凹陷同時發(fā)生并與第一條凹陷平行，將原有4分裂球細(xì)胞分成為8個，并呈現(xiàn)長方形排列。但8個細(xì)胞外形已有明顯區(qū)別，內(nèi)部4個細(xì)胞近似與正方形隆起，而外緣4個細(xì)胞則仍是外緣近似90度扇形的分裂球細(xì)胞；（2小時30分鐘）開始第四次分裂，同時出現(xiàn)兩條凹陷并與第一條凹陷都呈垂直的經(jīng)裂，分裂完成后外緣4個細(xì)胞較小，其余12個細(xì)胞大小相似，16個細(xì)胞呈有規(guī)則的長方形排列；（3小時05分鐘）開始第五次分裂，并形成了32個成二行排列的分裂球細(xì)胞，這時期分裂球細(xì)胞之間的界限已經(jīng)變得不明顯；（3小時05分鐘）開始第六次分裂，這時的發(fā)育已進(jìn)入到64細(xì)胞期，分裂球細(xì)胞不僅細(xì)胞間的界限變得不明顯，甚至出現(xiàn)了細(xì)胞部分重疊的情況；（3小時05分鐘）發(fā)育進(jìn)入到了多細(xì)胞期，呈現(xiàn)多層排列狀態(tài)的分裂球細(xì)胞，已經(jīng)很難分辨其具體的分裂球細(xì)胞個數(shù)，詳見表1。

表1　鄱陽湖土鯰胚胎發(fā)育分期

5.3囊胚階段

受精經(jīng)過（4小時15分鐘）后，分裂細(xì)胞團(tuán)緩慢隆起，整體呈現(xiàn)圓包形狀，隆起高度為整個受精卵長軸長的（3/7），早期囊胚的胚層隆起很高，可看見模糊的細(xì)胞界限。囊胚層細(xì)胞逐漸向植物極下方遷移，經(jīng)過（5小時05分鐘）后進(jìn)入囊胚中期，細(xì)胞界限逐漸不明顯，細(xì)胞團(tuán)中形成一個小腔，腔體中充滿液體。經(jīng)過（6小時10分鐘）后進(jìn)入囊胚晚期，囊壁的細(xì)胞下包生長，逐漸將卵黃部分包圍。下包過程中伴隨著囊胚腔被壓縮。囊胚層下包約達(dá)整個胚胎的1/3。外層也變得扁薄，透視可見囊胚腔。

5.4原腸胚階段

受精（7小時05分鐘）后，胚層邊緣隆起并下包胚層1/2，胚層隆起形成圓帽狀“胚環(huán)”，經(jīng)過（8小時15分鐘）后，圓帽狀“胚環(huán)”不斷增厚并內(nèi)卷，并逐漸增厚成盾狀。這時胚層持續(xù)下包，下包達(dá)到整個細(xì)胞4/5，這時的胚盾前端開始膨大，伴隨胚盾外緣伸長變薄，可觀察到沿著胚盾中線部分形成脊索原基，并可觀察到胚盾前端略微膨大的腦泡原基。

5.5神經(jīng)胚階段

在受精（11小時50分鐘）后，胚盾中線部分脊索原基處下陷成溝狀神經(jīng)溝，神經(jīng)溝位于胚體背側(cè)的正中位置，脊索原基與外胚層緊密結(jié)合。卵黃栓裸露于胚胎的表面，胚體頭端（動物極這一段）初顯腦部形態(tài)，可分辨出前、中、后三個腦泡，胚孔封閉與受精后11小時46分鐘，腦泡兩側(cè)可觀察到眼囊原基，并可見5～7對體節(jié)。

5.6器官分化階段

在受精（14小時45分鐘）后，眼囊原基內(nèi)陷成眼囊，然后在其中部可見圓形突起；橢圓形聽囊出現(xiàn)在胚體前端2/5處，這時體節(jié)數(shù)為11～14對；腦部分化更為明顯；在受精（15小時55分鐘）時，眼基前方可觀察到嗅板，尾牙開始游離出卵黃囊，并呈現(xiàn)球形尾泡，這時體節(jié)數(shù)為18～23對，受精（19小時25分鐘）時，整個胚體開始有微弱運動，開始出現(xiàn)肌肉收縮現(xiàn)象的發(fā)生，這種運動的發(fā)生的頻率為6～11次/分鐘。受精（22小時35分鐘）時，可見上頜須原基出現(xiàn)，位于頭部下方。尾牙游離成尾，長度為胚體長2/5，形成后的尾通過有規(guī)律的左右擺動，使得胚體沿著卵膜內(nèi)緣緩慢移動，并可觀察到鰓弓原基和鰓蓋原基先后出現(xiàn)在上頜須后下部和聽囊下部。受精（24小時35分鐘）時，心跳頻率逐漸加快到65～77次/分鐘，胚體扭動頻率也同步加快，扭動頻率和心跳頻率近于一致，奇鰭褶出現(xiàn)在尾部腹面，并逐漸的加長。受精（27小時35分鐘）時，這時的鰓蓋原基擴大并可觀察到3對左右的鰓弓，胚體沿卵膜內(nèi)緣做逆時針運動，而這時的卵膜也變薄，并伴隨有不規(guī)則的內(nèi)陷，卵膜緊貼膜內(nèi)胚體。

5.7出膜

受精（33小時50分鐘）時，被觀察樣本胚體尾部劇烈運動使內(nèi)胚膜破裂，尾部先轉(zhuǎn)出，脫出內(nèi)胚膜后尾部擺動頻率和幅度都加大，借著劇烈運動仔魚頭部也脫出胚膜，脫離的胚膜碎片逐漸溶解。剛剛脫膜的仔魚軀干部分淡綠色，近似于透明，卵黃囊呈現(xiàn)草綠色，受精后（39小時50分鐘），一半的被觀察樣本脫膜，受精后（47小時05分鐘），被觀察樣本全部完成脫膜。

鄱陽湖土鯰受精卵為圓形，通體草綠色，受精卵的大小為1.56毫米～1.71毫米，受精卵吸水膨脹的增幅大，外膜直徑達(dá)到了5.58毫米，吸水后受精卵外壁具有很強的彈性，能承受較強的外力沖擊，鄱陽湖土鯰受精卵吸水膨脹后通體具有中等粘性，容易附著細(xì)砂粒及其他類型微粒。

鄱陽湖土鯰受精卵在水溫22.0℃～26℃情況下，孵化出苗用時47小時05分鐘；與大多數(shù)鯰科發(fā)育時序相似，經(jīng)過胚盤期→卵裂期→囊胚期→原腸期→神經(jīng)胚期→器官分化期→出膜期這7個發(fā)育時期。相應(yīng)的發(fā)育期中又分為若干個階段。鄱陽湖土鯰卵裂期的8細(xì)胞時期到64細(xì)胞時期，分裂球排列成外緣成弧形的長方體，胚胎發(fā)育至64細(xì)胞期后分裂球重疊程度變大，分裂球細(xì)胞間的界限變得沒有明顯規(guī)律。同時卵黃運動較劇烈，運動周期較短，有利于細(xì)胞層的下擴。在器官分化期之前的各發(fā)育時期階段胚胎發(fā)育緩慢，進(jìn)入到器官分化期后，胚胎發(fā)育加速。腦泡及眼囊分化、嗅板和聽囊的分化、頜須原基的形成、肌節(jié)的加速形成，使得鄱陽湖土鯰仔魚出膜后感覺器官已初步形成。

孵化的水溫和累計時間與其他鯰形目品種之間的比較，鄱陽湖土鯰的孵化在水溫22.0℃～26℃情況下，孵化出苗用時47小時05分鐘；南方大口鯰孵化在水溫23.1℃～25.8℃情況下，孵化出苗用時30小時27分鐘；瓦氏黃顙魚（同為鯰形目）的孵化在水溫23.0℃～25.0℃情況下，孵化出苗用時50～60小時。

在18℃～26℃的溫度范圍內(nèi)，南方大口鯰孵化時間最短，其次為鄱陽湖土鯰，然后是瓦氏黃顙魚。鄱陽湖土鯰胚胎發(fā)育情況見表2。

表2　鄱陽湖土鯰胚胎發(fā)育分期圖

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江西省科技支撐計劃（20121BBF60037）：鄱陽湖土鯰繁養(yǎng)殖關(guān)鍵技術(shù)研究

S943

ADOI編號：10.14025/j.cnki.jlny.2016.20.024

姚毅，碩士，南昌市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，工程師，研究方向：遺傳育種和農(nóng)業(yè)物聯(lián)網(wǎng)。