王瑞軍

（黑龍江農(nóng)墾科技職業(yè)學(xué)院，黑龍江哈爾濱　150431）

大豆胰蛋白酶抑制劑失活的研究

王瑞軍

（黑龍江農(nóng)墾科技職業(yè)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150431）

利用酶、溫度、酸堿度、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4個(gè)因素對胰蛋白酶抑制劑的影響及相互作用，將胰蛋白酶抑制劑降至最低。試驗(yàn)得到最適酶為胃蛋白酶，其用量為0.001 2 g/3 g，溫度為70℃，pH值為7，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9%；其中，酶的用量和溫度的升降對胰蛋白酶抑制劑有顯著的影響。經(jīng)過驗(yàn)證試驗(yàn)表明，該結(jié)果有效可靠。

胰蛋白酶抑制劑；大豆；失活

0　引言

通過鮑曼·貝爾克和庫尼茲2位科學(xué)家的努力，研究人員對胰蛋白酶抑制劑（Trypsin inbitor，TI）有了一定的了解［1-7］。目前，國內(nèi)外主要采用加熱的方法去除大豆中的胰蛋白酶抑制劑，但會對大豆中營養(yǎng)成分有所損害，不益于人體健康。因此，應(yīng)采用多種因素對胰蛋白酶抑制劑進(jìn)行影響，使大豆中的營養(yǎng)成分損失最低。本試驗(yàn)通過對酶溫度、pH值、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4個(gè)因素對胰蛋白酶抑制劑的影響，選擇4個(gè)因素最適水平范圍進(jìn)行正交試驗(yàn)，經(jīng)方差分析和多重比較得出最優(yōu)組合，然后進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得出結(jié)論。

1　大豆胰蛋白酶抑制劑失活的研究

1.1試驗(yàn)設(shè)備及材料

1.1.1試驗(yàn)材料及試劑

大豆、胰蛋白酶（Sigma公司）、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、酪蛋白、三氯乙酸、蒸餾水。

1.1.2試驗(yàn)儀器設(shè)備

紫外分光光度計(jì)，北京普哲通用儀器有限公司產(chǎn)品；HH-1型水浴鍋，江蘇省金壇市儀器制造有限公司產(chǎn)品；PHS-3C型pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；電子天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；LD5-2A型離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠產(chǎn)品；分析天平，北京醫(yī)用天平廠產(chǎn)品。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1最適波長的測定

取胰蛋白酶0.5 g，加50.0 mL蒸餾水溶解，配制成1%胰蛋白酶溶液，通過紫外分光光度計(jì)，對波長在275～300 nm的吸光度進(jìn)行測定，得到最大吸收波長為283 nm。

1.2.2胰蛋白酶抑制劑活性的測定［8］

在35℃，水浴20 min條件下，主要是應(yīng)用三氯乙酸使胰蛋白酶抑制劑失活的機(jī)理，通過調(diào)整提取液與三氯乙酸加入的順序不同，先測出胰蛋白酶活性，之后用三氯乙酸使提取液中的胰蛋白酶抑制劑失活，再用二者的差值得出胰蛋白酶抑制劑活性。

胰蛋白酶抑制活性測定見表1。

對上述配制溶液進(jìn)行離心（轉(zhuǎn)速為3 000 r/min）10 min，取上清液于最適波長處測光密度值。

1.2.3計(jì)算活性

（1）胰蛋白酶活性單位。每1 min水解蛋白在最適波長處增加0.01個(gè)吸收度的活性為1個(gè)單位。公式為：

表1　胰蛋白酶抑制活性測定

（2）胰蛋白酶抑制因子活性單位。每1 min使胰蛋白在最適波長處降低一個(gè)吸收度的活性為1個(gè)單位。公式為：胰蛋白酶抑制因子活性=

1.3溶液的配制

1.3.1豆粉溶液的制備

市售有機(jī)大豆，用石磨研磨3次，過80目篩，得粉末，干燥保藏。準(zhǔn)確稱取豆粉3 g，置于試管中，用150 mL蒸餾水稀釋，混勻。

1.3.1磷酸緩沖液的配制［9］

（1）0.1 mol/L Na2HPO4制備。取Na2HPO4·12H2O 17.91 g加水溶解并定容至500 mL。

（2）0.1 mol/L NaH2PO4制備。取NaH2PO4·2H2O 7.805 g加水溶解并定容至500 mL。

取435.0 mL 0.1 mol/L Na2HPO4溶液與65.0 mL 0.1 mol/L NaH2PO4溶液混合，調(diào)整pH值至7.6，即為0.1 mol/L磷酸緩沖液。

1.3.2胰蛋白酶液的制備

精密吸取25.0 mg胰蛋白酶，溶解于0.001 mol/L鹽酸溶液中，定容至100 mL。

1.4試驗(yàn)方案

1.4.1單因素試驗(yàn)

（1）pH值對胰蛋白酶抑制劑的影響。在溫度為25℃，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的原溶液中，確定pH值為4，5，7，8，9，測定每個(gè)水平TI的活性。

（2）溫度對胰蛋白酶抑制劑的影響。在pH值為6，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的原溶液中，確定溫度為50，60，70，80，90℃，測定每個(gè)水平TI的活性。

（3）底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對胰蛋白酶抑制劑的影響。在溫度為25℃，pH值為6的原溶液中，確定底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，9%，13%，17%，20%，測定每個(gè)水平TI的活性。

（4）胃蛋白酶對胰蛋白酶抑制劑的影響。在pH值為2，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的原溶液中分別加入0.000 6，0.001 2，0.001 8，0.002 4，0.003 0 g胃蛋白酶，溫度為40℃，加熱10 min，測定每個(gè)水平TI的活性。

（5）木瓜蛋白酶對胰蛋白酶抑制劑的影響。在pH值為6，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的原溶液中分別加入0.000 6，0.001 2，0.001 8，0.002 4，0.003 0 g木瓜蛋白酶，溫度為65℃，加熱10 min，測定每個(gè)水平TI的活性。

1.4.2正交試驗(yàn)

因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

表2　因素與水平設(shè)計(jì)

1.4.3驗(yàn)證試驗(yàn)

通過正交試驗(yàn)分析可得到最優(yōu)組合，與正交試驗(yàn)最大值相比較進(jìn)行驗(yàn)證。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1pH值對胰蛋白酶抑制劑的影響

pH值對胰蛋白酶抑制劑的影響見圖1。

圖1　pH值對胰蛋白酶抑制劑的影響

由圖1可知，最適pH值為4，5，7。

胰蛋白酶抑制劑只有在最適pH值條件下才穩(wěn)定，過酸或過堿都會引起胰蛋白酶抑制劑的變性而改變其活性。因?yàn)殡S著pH值的變化會影響胰蛋白酶抑制劑上許多極性基團(tuán)的離子特性，在不同pH值條件下，這些基團(tuán)的解離狀態(tài)不同，只有在胰蛋白酶抑制劑最佳狀態(tài)下，才能發(fā)揮其最大活性。

2.1.2溫度對胰蛋白酶抑制劑的影響

溫度對胰蛋白酶抑制劑的影響見圖2。

由圖2可知，最適溫度為50，60，70℃。

當(dāng)溫度升高時(shí)，反應(yīng)速度加快，這與一般化學(xué)反應(yīng)一樣，從而提高胰蛋白酶抑制劑的活性；然而，隨著溫度升高而使胰蛋白酶抑制逐步變性，進(jìn)而降低胰蛋白酶抑制劑活性。

圖2　溫度對胰蛋白酶抑制劑的影響

2.1.3底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對胰蛋白酶抑制劑的影響

底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對胰蛋白酶抑制劑的影響見圖3。

圖3　底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對胰蛋白酶抑制劑的影響

由圖3可知，最適底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9%，13%，17%。

胰蛋白酶抑制劑有一定的大小和幾何形狀，因此對底物進(jìn)行選擇。大小和幾何形狀不合適的分子不能與活性接觸，而且只有進(jìn)行有效碰撞才能進(jìn)行反應(yīng)。隨原溶液底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，底物與胰蛋白酶抑制劑接觸的幾率增大，胰蛋白酶抑制劑活性升高。然而，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到一定程度就會阻礙反應(yīng)物的有效碰撞，從而使胰蛋白酶抑制劑的活性降低。

2.1.4胃蛋白酶對胰蛋白酶抑制劑的影響

胃蛋白酶對胰蛋白酶抑制劑的影響見表3。

表3　胃蛋白酶對胰蛋白酶抑制劑的影響

2.1.5木瓜蛋白酶對胰蛋白酶抑制劑的影響

木瓜蛋白酶對胰蛋白酶抑制劑的影響見表4。

2.1.6對比［10］

對比2種酶（胃蛋白酶、木瓜蛋白酶）對胰蛋白酶抑制劑失活的影響，選擇最佳的酶。

木瓜蛋白酶與胃蛋白酶對比見圖4。表4木瓜蛋白酶對胰蛋白酶抑制劑的影響

圖4　木瓜蛋白酶與胃蛋白酶對比

由圖4可知，胃蛋白酶在0.001 2～0.002 4 g/3 g時(shí)，活性最大，而木瓜蛋白酶在0.000 6～0.001 8 g/3 g的活性最大；但從總體上看，胃蛋白酶對胰蛋白酶抑制劑的影響要大于木瓜蛋白酶對胰蛋白酶抑制劑的影響。主要是因?yàn)槲傅鞍酌甘撬嵝缘鞍酌?，而木瓜蛋白酶是中性蛋白酶，酸性蛋白酶對胰蛋白酶的抑制要大于中性蛋白酶的抑制?/p>

2.2L9（34）正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表5，方差分析見表6，直觀分析見圖5。

表5　正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

表6　方差分析

2.3驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)過直觀分析法可知溫度為70℃，胃蛋白酶用量0.001 2 g/3 g，pH值為7，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9%進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。與第8組試驗(yàn)相比，經(jīng)過3次試驗(yàn)，得到平均值2.130＞2.125，由此可證實(shí)試驗(yàn)成功。

3　討論與結(jié)論

本次試驗(yàn)利用綜合處理的方法，應(yīng)用多種因素對胰蛋白酶抑制劑進(jìn)行影響。通過驗(yàn)證試驗(yàn)證明結(jié)論具有一定的可行性，可以有效地去除大豆中的胰蛋白酶抑制劑，為后續(xù)研究提供一定的依據(jù)。

從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，胃蛋白酶對胰蛋白酶抑制劑影響最大，這體現(xiàn)酶的高效性；溫度對胰蛋白酶抑制劑也比較顯著，但長時(shí)間加熱也會使蛋白質(zhì)變性，有效賴氨酸數(shù)量因美拉德反應(yīng)而降低。而且，鮑曼-貝爾克中含有多個(gè)二硫鍵高度重疊的分子結(jié)構(gòu)，具有極高的耐熱性。

胰蛋白酶抑制劑的性質(zhì)及一些功能已經(jīng)證實(shí)，但是要對其做全面的認(rèn)識，特別是對其抗性機(jī)制的研究，必須做進(jìn)一步的探索。應(yīng)用物理、化學(xué)、微生物及酶制劑綜合作用的研究方法去除大豆中的胰蛋白酶抑制劑，這樣不僅可以去除其中胰蛋白酶抑制劑的活性，還可以減少蛋白質(zhì)的大量變性，而且加快大豆加工生產(chǎn)工藝流程，同時(shí)節(jié)省能源，更好地增加豆制品的營養(yǎng)價(jià)值，提高其功能特性。

［1］石彥國，任麗.大豆制品工藝學(xué) ［M］.北京：中國輕工出版社，1998：8.

［2］Kwok K C，Qin W H，Tsang J C.Heat in activation of the research advance in the inactivating methods of soybean trypsinhibitor［J］.Journal of Food Science，1993，58（4）：859-862.

［3］Espin N，Oslam M N.Stabilization of pa pain from papaya peels［J］.FoodScienceandTechnologyinTernational，1998，4（3）：179-181.

［4］霍貴成，楊麗杰.豆科植物中抗?fàn)I養(yǎng)因子 ［J］.飼料博覽，1996（8）：5-7.

［5］萬善霞，張淑平.胰蛋白酶抑制劑在不同領(lǐng)域的研究概況 ［J］.北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002（10）：20-23.

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［7］Iosif A V，Haram B Y.Prote olysis of kunitz soybean trypsin inhibitor，in fluenceon its activity［J］.J Agric Food Chem，1995，43（4）：862-866.

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［9］吳非，霍貴成.酶法頓化大豆胰蛋白酶抑制劑研究 ［J］.糧食與油脂，2002（6）：9-10.

［10］王欽得，楊堅(jiān).食品實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析 ［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2003：2-4.◇

Study on Soybean Trgpsin Inhibitor Inactivation

WANG Ruijun
（Heilongjiang Land Reclamation Vocational College of Techology，Harbin，Heilongjiang 150431，China）

There are four factors affect trypsin inhibitor：enzyme，temperature，acid and alkali degree，reactive volume，which are affect each other，and make trypsin inhibitor active fall.The experients results show that：gastric protein enzyme 0.001 2 g/3 g，temperature 70℃，pH 7，reactive volume 9%.The two factors which affect trypsin inhibitor very remarkable are enzyme volume and temperature.We have proved experiment and prove experiment result which is right.

trypsin inhibitor；soybean；inactivation

Q503

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.01.032

2015-11-20

王瑞軍（1979— ），男，本科，工程師，研究方向?yàn)榧Z油加工。