朱成華，施麗君，張靈鳳，計曉蘭，杜強

PM 2.5對支氣管上皮細(xì)胞色素上皮衍生因子表達(dá)的影響①

朱成華1，2，施麗君2，張靈鳳2，計曉蘭2，杜強1，2

目的探索不同濃度PM 2.5對支氣管上皮細(xì)胞（BEAS-2B）色素上皮衍生因子（PEDF）蛋白表達(dá)的影響。方法BEAS-2B細(xì)胞傳代培養(yǎng)，加入低、中、高濃度PM 2.5懸液（25μg/m l、50μg/m l、100μg/m l）刺激24 h。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中PEDF水平；Western blotting檢測BEAS-2B細(xì)胞中PEDF蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與對照組相比，PM 2.5濃度為25 μg/m l時，細(xì)胞內(nèi)和上清液中PEDF蛋白水平均有增加趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義（t=-0.730，t=-1.840，P＞0.05）；PM 2.5濃度為50μg/m l 和100μg/m l時，細(xì)胞內(nèi)和上清液中PEDF蛋白表達(dá)水平明顯增高（t＞5.798，P＜0.01）。結(jié)論中、高濃度PM 2.5能夠增加支氣管上皮細(xì)胞中PEDF蛋白水平，并呈濃度依賴性。

細(xì)顆粒物；支氣管上皮細(xì)胞；色素上皮衍生因子

［本文著錄格式］朱成華，施麗君，張靈鳳，等.PM 2.5對支氣管上皮細(xì)胞色素上皮衍生因子表達(dá)的影響［J］.中國康復(fù)理論與實踐，2016，22（10）：1151-1153.

CITED AS：Zhu CH，Shi LJ，Zhang LF，etal.Effectsof PM 2.5 on expression of pigmentepithelium-derived factor in bronchialepithelial cells［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（10）：1151-1153.

近年來，細(xì)顆粒物（particulatematter，PM）2.5污染已成為我國許多大中城市空氣污染的罪魁禍?zhǔn)祝彩怯绊懢用裆硇慕】档闹匾蛩兀?］。PM 2.5暴露可以誘導(dǎo)氣道炎癥及氧化應(yīng)激損傷［2］。色素上皮衍生因子（pigmentepithelium-derived factor，PEDF）是一種具有多功能的糖蛋白，最初從胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)液分離，在慢性氣道炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用［3］。一方面PEDF具有抗炎和抗氧化等生物學(xué)特性［3］，同時亦通過促炎作用參與氣道炎癥的形成［4-5］。本實驗旨在觀察不同濃度PM 2.5干預(yù)對人支氣管上皮細(xì)胞（bronchial epithelial cells，BEAS）PEDF蛋白表達(dá)水平的影響。

1　材料與方法

1.1試劑

PEDF抗體、GAPDH抗體：ABCAM公司，英國。BEAS-2B細(xì)胞：ATCC公司，美國。PEDF酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒：EBIOSCIENCE公司，美國?？偟鞍滋崛≡噭┖校篠IGMA公司，美國。

1.2方法

1.2.1PM 2.5的提取

參照我們前期發(fā)表的文獻(xiàn)［6］，采用TH-150中流量總懸浮微粒采樣器（武漢天虹）采樣，采樣點位于南京市鼓樓區(qū)，經(jīng)超聲洗脫處理后收集PM 2.5，滅菌后真空冷凍干燥，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2BEAS-2B細(xì)胞的培養(yǎng)

BEAS-2B細(xì)胞接種于50m l培養(yǎng)瓶，使用1640培養(yǎng)液和10%胎牛血清培養(yǎng)細(xì)胞，每隔3天換液1次，當(dāng)細(xì)胞融合后，用PBS液洗滌2次，加入適量0.25%胰酶消化，顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞收縮成圓形后，棄去消化液，加入培養(yǎng)液，無菌吸管吹打數(shù)次至貼壁細(xì)胞全浮起，接種于六孔培養(yǎng)板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。初始細(xì)胞接種密度為（2～5）×105/m l。

1.2.3PM 2.5刺激

當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期、細(xì)胞融合達(dá)80%，吸棄培養(yǎng)基，以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h后，分為四組。對照組不加PM 2.5懸液（PM 2.5用培養(yǎng)基溶解）；PM 2.5低、中、高濃度組分別加入PM 2.5懸液25μg/m l、50 μg/m l、100μg/m l。PM 2.5懸液刺激24 h后收集上清液和細(xì)胞用于檢測。

1.2.4ELISA

采用ELISA法檢測BEAS-2B細(xì)胞上清液中PEDF蛋白的表達(dá)。收集細(xì)胞上清標(biāo)本，參照ELSIA試劑盒說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀在490 nm處測吸光度光密度（OD）值，繪制標(biāo)本曲線，檢測標(biāo)本濃度。

1.2.5Western blotting

使用總蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白（凱基生物工程有限公司，南京），二喹啉甲酸法測定濃度。按試劑盒說明書進(jìn)行操作。BCA法測定蛋白濃度。Western blotting法檢測PEDF蛋白表達(dá)水平。GAPDH作為內(nèi)參，使用10%SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)印將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉；加入1 ∶1000抗PEDF單克隆抗體4℃過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗常溫孵育90m in。TBST洗滌，ECL發(fā)光顯影，Bio-Rad Quantity One軟件分析數(shù)據(jù)。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1ELISA

PM 2.5低濃度組PEDF蛋白有升高趨勢，但與對照組比較無顯著性差異（P＞0.05）；PM 2.5中、高濃度組PEDF蛋白水平明顯增加（P＜0.01），且呈濃度依賴性。見表1。

表1　各組BEAS-2B細(xì)胞上清液PEDF蛋白水平（ng/m l）

2.2Western blotting

PM 2.5低濃度組PEDF蛋白有升高趨勢，但與對照組比較無顯著性差異（P＞0.05）；PM 2.5中、高濃度組PEDF蛋白水平顯著增加（P＜0.001），且呈濃度依賴性。見表2、圖1。

表2　各組BEAS-2B細(xì)胞分泌PEDF蛋白/GAPDH蛋白水平

圖1　不同濃度PM 2.5刺激24 h后PEDF蛋白的Western blotting結(jié)果

3　討論

PM 2.5是空氣動力學(xué)直徑小于2.5μm的大氣細(xì)顆粒物，它不僅能沉積到肺泡，進(jìn)入血液循環(huán)，而且能夠攜帶某些化學(xué)物質(zhì)及有機物，對人體造成極大傷害［7］。PM 2.5暴露不僅可以導(dǎo)致哮喘的始發(fā)，同時可以加重哮喘氣道炎癥，誘導(dǎo)哮喘患者急性發(fā)作［8］。同樣，PM 2.5能夠通過加重氣道炎癥及氧化應(yīng)激損傷，引起慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）急性加重［9］。PM 2.5能夠誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞以及肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS能夠激活下游的轉(zhuǎn)錄因子如核因子（nuclear factor，NF）-κB等，引起多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放，如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細(xì)胞介素（nterleukin，IL）-8等，進(jìn)而引起氣道炎癥反應(yīng)加劇或延長，最終導(dǎo)致慢性重癥氣道炎癥的形成［2］。

PEDF是一種多功能糖蛋白，在多個組織中均有表達(dá)，如肺組織、脂肪組織和心肌細(xì)胞等［4］。既往研究表明，在卵蛋白致敏哮喘小鼠，補充外源性PEDF蛋白能夠抑制氣道炎癥及重塑，提示PEDF在支氣管哮喘的發(fā)病機制中具有重要作用，其抑制氣道炎癥的作用機制可能與抑制血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)有關(guān)［3］。COPD患者血清中PEDF蛋白表達(dá)水平明顯增高，其參與COPD的發(fā)病機制不明，可能通過促進(jìn)相關(guān)炎癥因子的釋放，如IL-8、TNF-α、IL-6等［10］。多項研究表明，PEDF不僅具有抗炎、抗氧化等生物學(xué)特性，同時PEDF亦具有重要的促炎作用：小鼠脂肪細(xì)胞分泌的PEDF可活化巨噬細(xì)胞，引起TNF-α和IL-1β的釋放，導(dǎo)致慢性炎癥，其部分機制與激動細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2 和p38絲裂原活化蛋白激酶（m itogen-activated protein kinase，p38MAPK）相關(guān)［4］；在人血管平滑肌細(xì)胞中，PEDF可以激活NF-κB途徑促進(jìn)炎癥反應(yīng)［5］。

本實驗觀察PM 2.5對BEAS-2B細(xì)胞中PEDF蛋白表達(dá)水平影響，結(jié)果顯示，低濃度PM 2.5對BEAS-2B細(xì)胞PEDF蛋白表達(dá)無影響；而中、高濃度的PM 2.5能夠顯著增加BEAS-2B細(xì)胞PEDF蛋白水平，且呈濃度依賴性。其可能原因與其激動相關(guān)炎癥信號通路如ERK1/2、p38MAPK等有關(guān)。具體機制有待進(jìn)一步研究。

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Effectsof PM 2.5 on Expression of Pigment Epithelium-derived Factor in Bronchial EpithelialCells

ZHU Cheng-huɑ1，SHILi-jun2，ZHANG Ling-feng2，JIXiɑo-lɑn2，DU Qiɑng1
1.Departmentof Respiration Medicine，No.2 Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing，Jiangsu 210011，China；2.the Second ClinicalMedical Schoolof Nanjing MedicalUniversity，Nanjing，Jiangsu 210011，China
Correspondence to DUQiɑng.E-mail：jingshuyue@163.com

Objective To explore the effect of particulate matter（PM）2.5 on the expression of pigment epithelium-derived factor （PEDF）protein in bronchialepithelial cells（BEAS-2B）. Methods Human BEAS-2B were subcultivated，followed by low，medium and high concentrationsof PM 2.5（25μg/m l，50μg/m l，100μg/m l）stimulation for 24 hours.The expression of PEDF protein in supernatantwasanalyzed by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA），and the expression in BEAS-2B cells was detected by Western blotting.Results Compared with the control group，the expression of PEDF protein in supernatant and BEAS-2B cells induced by PM 2.5（25μg/m l）increased，butno significancewas found（t=-0.730，t=-1.840，P＞0.05），and the expression induced by PM 2.5 with the concentrations of 50 μg/m land 100μg/m lsignificantly increased（t＞5.798，P＜0.05）.Conclusion PM 2.5with the concentrationsof 50μg/m land 100μg/m l could increase theexpression of PEDFprotein in a concentration-dependentmannerboth in supernatantand BEAS-2B cells.

particulatematter；bronchialepithelialcells；pigmentepithelium-derived factor

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.10.008

R562.2

A

1006-9771（2016）10-1151-03

1.江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生實踐創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目（No.201410312015Z）；2.江蘇省六大人才高峰項目（No.WSN-015）。

1.南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸科，江蘇南京市210011；2.南京醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇南京市210011。作者簡介：朱成華（1986-），男，漢族，江蘇淮安市人，碩士研究生，主治醫(yī)師，主要研究方向：支氣管哮喘的基礎(chǔ)與臨床。施麗君（1990-），女，漢族，江蘇南通市人，碩士研究生，主要研究方向：支氣管哮喘的基礎(chǔ)與臨床。朱成華和施麗君并列為第一作者。通訊作者：杜強，男，博士，副教授。E-mail：jingshuyue@163.com。

（2016-05-23

2016-07-19）