羅 文，張三林

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冠脈寧口服液干預(yù)ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的實驗研究

羅 文，張三林

目的 探討冠脈寧口服液對ApoE基因敲除小鼠(ApoE-/-小鼠)動脈粥樣硬化病變(AS)的影響及其機制。方法 30只以C57BL/6J為背景的10周齡ApoE-/-小鼠，高脂飼料喂養(yǎng)12周后隨機分為3組：模型組、冠脈寧組、復(fù)方丹參組，每組10只。冠脈寧組給予冠脈寧口服液20 g/(kg·d)灌服；復(fù)方丹參組給予復(fù)方丹參溶液3.5 g/(kg·d)灌服；模型組給予等量生理鹽水灌服。另設(shè)10只相同背景和周齡的普通飼料喂養(yǎng)的C57BL/6J小鼠作為空白對照組。分別給藥12周后小鼠摘除眼球采血，酶法檢測血脂水平，ELISA方法檢測血清中內(nèi)臟脂肪素(visfatin)、白介素-6(IL-6)水平。HE染色觀察小鼠主動脈病理形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果 空白對照組主動脈未見動脈粥樣硬化改變，模型組有較明顯的主動脈內(nèi)膜增厚及粥樣斑塊的形成。模型組血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平及血清中visfatin、IL-6的表達(dá)顯著高于空白對照組，而高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平則顯著低于空白對照組(P<0.05)。與模型組比較，冠脈寧組、復(fù)方丹參組TC、TG、LDL-C水平及血清中visfatin、IL-6水平顯著降低(P<0.05)，而HDL-C水平顯著升高(P<0.05)，且病理損傷程度減輕。冠脈寧組與復(fù)方丹參組比較，血脂指標(biāo)、visfatin、IL-6水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 冠脈寧口服液可降低ApoE-/-小鼠的血脂水平及血清中visfatin、IL-6水平，具有一定的抗動脈粥樣硬化作用，可能通過調(diào)節(jié)血脂代謝、降低炎癥細(xì)胞因子水平達(dá)到抑制動脈粥樣硬化進(jìn)展、穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊的目的。

動脈粥樣硬化；ApoE基因；內(nèi)臟脂肪素；白介素-6；冠脈寧口服液

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是引起冠心病的病理基礎(chǔ)，已經(jīng)成為導(dǎo)致人類死亡的首要病因。已有大量的證據(jù)表明：脂質(zhì)代謝和炎癥反應(yīng)異常與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系[1]，因此降脂和抑制炎癥反應(yīng)能更有效地抑制AS病變的發(fā)生發(fā)展。

臨床研究表明：冠脈寧口服液對冠心病心絞痛有較顯著的療效，并能有效改善生化指標(biāo)，具有抗AS、調(diào)節(jié)脂代謝的作用[2]。本研究通過高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠制備動脈粥樣硬化模型，觀察冠脈寧口服液對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的干預(yù)作用，探討其改善AS進(jìn)程及穩(wěn)定斑塊的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 30只10周齡雄性ApoE-/-小鼠，品系C57BL/6J，體重18 g～20 g，10只相同遺傳背景和周齡的雄性C57BL/6J小鼠，體重18 g～20 g，均購自常州卡文斯實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(蘇)2011-0003。高脂飼料(2.0%膽固醇，2.5%豬膽鹽，10.0%豬油加入小鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料中混勻)由常州卡文斯實驗動物有限公司提供。

1.2 試驗藥物與試劑 冠脈寧口服液，批號濟聯(lián)制字(2001)FP10024(21)，中國人民解放軍第三七一醫(yī)院提供。復(fù)方丹參片，批號Z44023372，廣州白云山和記黃埔中藥有限公司生產(chǎn)。血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒，購自北京中生北控生物科技股份有限公司；內(nèi)臟脂肪素(visfatin)ELISA試劑盒(批號：AK0015FEB02001)購自Elabscience公司；白細(xì)胞介素-6(IL-6)ELISA 試劑盒(批號：00604)購自晶美生物工程有限公司，美國Oriono Diagostica公司生產(chǎn)。

1.3 儀器 德國Thermo酶標(biāo)定量測定儀；瑞士羅氏公司COBAS EMIRA 型全自動生化儀；Eclipse Ti熒光倒置顯微鏡，日本尼康公司。

1.4 造模、分組與給藥 將30只ApoE-/-小鼠分5只1籠飼養(yǎng)于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院河南省醫(yī)用組織再生重點實驗室動物房內(nèi)，經(jīng)普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后給予高脂飼料，連續(xù)喂養(yǎng)12周后隨機分為3組：模型組、冠脈寧組、復(fù)方丹參組，每組10只。冠脈寧組給予冠脈寧口服液20 g/(kg·d)灌服；復(fù)方丹參組給予復(fù)方丹參溶液3.5 g/(kg·d)灌服；模型組給予等量生理鹽水灌服。另設(shè)10只相同遺傳背景和周齡標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)的C57BL/6J小鼠作為空白對照組。

1.5 標(biāo)本采集與處理 12周后停止藥物干預(yù)，結(jié)束實驗。所有小鼠禁食12 h，眼球摘除法獲得血液標(biāo)本，經(jīng)3 000 r/min離心10 min后，取上清液，凍存于-20 ℃冰箱保存。酶法檢測小鼠血清血脂水平，ELISA法檢測血清visfatin含量。小鼠處死后打開胸腔，剪開心包，暴露心臟，由心尖部灌注生理鹽水5 min，再灌注4%多聚甲醛5 min行主動脈固定。自主動脈根部至腹主動脈末端分離整條主動脈，將主動脈組織投入新鮮配制的4%多聚甲醛固定液中在4 ℃冰箱過夜，次日置換緩沖液。取橫切面的小鼠主動脈標(biāo)本，常規(guī)經(jīng)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋處理后制作病理切片。每張切片厚5 μm，每間隔8張取1張做HE染色，進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠一般情況 在造模、藥物干預(yù)期間各組小鼠均無死亡；對各組小鼠攝食情況觀察發(fā)現(xiàn)：模型組、冠脈寧組、復(fù)方丹參組小鼠在藥物干預(yù)期間飲食量減少(約每只6 g/d高脂飼料)，飲水正常；空白對照組小鼠實驗期間正常飲食、飲水(約每只10 g/d標(biāo)準(zhǔn)飼料)；對各組小鼠活動能力及靈敏度觀察：與其他組比較，冠脈寧組小鼠明顯表現(xiàn)出較強的活動能力和較高的反應(yīng)靈敏度；各組小鼠實驗結(jié)束后體重均有一定程度的增加。模型組、冠脈寧組、復(fù)方丹參組、空白對照組體重增加值分別為(7.07±2.47)g、(4.67±0.85)g、(4.42±1.26)g、(3.96±1.31)g，各給藥組小鼠體重增加值均低于模型組(P<0.05)，冠脈寧組與復(fù)方丹參組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組小鼠血脂指標(biāo)的變化 模型組TC、TG、LDL-C水平顯著高于空白對照組，而HDL-C水平則顯著低于空白對照組(P<0.05)。與模型組比較，冠脈寧組、復(fù)方丹參組TC、TG、LDL-C水平顯著降低(P<0.05)，而HDL-C水平顯著升高(P<0.05)，冠脈寧組與復(fù)方丹參組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組小鼠血脂水平比較(±s) mmol/L

2.3 各組小鼠血清visfatin水平的變化 與空白對照組比較，模型組血清visfatin、IL-6水平明顯增高(P<0.05)；與模型組比較，冠脈寧組、復(fù)方丹參組血清visfatin、IL-6水平降低(P<0.05)；冠脈寧組與復(fù)方丹參組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

ng/mL

2.4 各組小鼠主動脈病理形態(tài)學(xué)改變 空白對照組C57BL/6J小鼠主動脈中膜平滑肌細(xì)胞排列規(guī)則，主動脈壁內(nèi)膜較薄，結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)膜下無脂質(zhì)沉積，未見泡沫細(xì)胞形成等動脈粥樣硬化改變(圖1A)。各組ApoE-/-小鼠主動脈壁存在不同程度的動脈粥樣硬化病灶形成。其中模型組可見中膜平滑肌細(xì)胞增生并且排列紊亂，主動脈內(nèi)膜增厚、內(nèi)皮細(xì)胞部分脫落，動脈粥樣硬化斑塊體積較大，大量泡沫細(xì)胞形成和堆積，突向管腔，管腔明顯狹窄(圖1B)。冠脈寧組和復(fù)方丹參組AS 病變較模型組顯著減輕，兩組動脈壁仍可見明顯的內(nèi)膜增厚和動脈粥樣斑塊形成，但斑塊面積明顯減小，內(nèi)膜相對平整，斑塊中可見少量空泡及增生細(xì)胞形成，中膜下有少量細(xì)胞增生，中膜平滑肌排列相對規(guī)則(圖1C、圖1D)。

注：A為空白對照組；B為模型組；C為冠脈寧組；D為復(fù)方丹參組。

圖1 各組小鼠主動脈病理觀察(免疫組化，×200)

3 討 論

近年來，越來越多的研究證實：炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)代謝異常在AS的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，并且貫穿于AS斑塊的形成、生長到破裂的全部過程。內(nèi)臟脂肪素是一種近幾年新發(fā)現(xiàn)與炎癥和代謝綜合征有關(guān)的脂肪組織分泌的細(xì)胞因子[3]。visfatin具有多種生物學(xué)活性，如參與炎癥反應(yīng)應(yīng)答、誘導(dǎo)血管生成、延緩中性粒細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)脂代謝等[4]。多名學(xué)者臨床研究發(fā)現(xiàn)，冠心病病人血清visfatin水平顯著升高，且冠心病病變程度愈重，visfatin 水平愈高，是獨立于已知冠心病危險因素的又一新的危險因素[5-6]。Dahl 等[7]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：visfatin 大量表達(dá)于動脈粥樣硬化斑塊的巨噬細(xì)胞中，可能參與斑塊發(fā)展進(jìn)程，故建議將PBEF/visfatin作為介導(dǎo)心血管病改變的炎癥因子。

IL-6是近年來研究較多的一種多效應(yīng)細(xì)胞因子，能趨化、活化中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子和其他炎癥遞質(zhì)，增強局部的炎癥反應(yīng)。目前有研究顯示酪氨酸激酶JAK/STAT信號可能是AS發(fā)生發(fā)展重要通路[8]，而機體重要的炎癥因子IL-6調(diào)控的STAT3信號系統(tǒng)是其中主要的炎癥通路[9-11]。AS不穩(wěn)定斑塊中富含炎癥介質(zhì)以及含剩余游離膽固醇巨噬細(xì)胞。游離膽固醇在巨噬細(xì)胞內(nèi)的堆積可以導(dǎo)致炎癥因子IL-6的分泌[12]。IL-6介導(dǎo)的白細(xì)胞黏附增加促進(jìn)斑塊的不穩(wěn)定性，削弱了斑塊處的纖維帽，加速斑塊裂隙，IL-6可刺激基質(zhì)降解酶的合成，侵蝕斑塊內(nèi)的基質(zhì)，最終導(dǎo)致斑塊破裂，并介導(dǎo)血栓形成[13]，是大多數(shù)急性冠脈綜合征發(fā)生的主要原因[14-15]。

中醫(yī)認(rèn)為本病病機為本虛標(biāo)實，所謂本虛是指氣血陰陽虛弱，標(biāo)實多為氣滯血瘀、痰濁內(nèi)阻，標(biāo)實多在本虛基礎(chǔ)上發(fā)展而來，多相互影響，但基本病機為氣虛血瘀，氣虛血瘀是發(fā)病關(guān)鍵，貫穿本病發(fā)病的全過程，大多數(shù)學(xué)者強調(diào)益氣活血化瘀為本病基本治療方法[16]。以益氣活血為治則的中成藥冠脈寧口服液重用黃芪益氣升陽固本、三棱活血化瘀、薤白祛濕化痰，三藥合用，益氣活血、理氣止痛、祛濕化痰，標(biāo)本兼治。有資料報道[2]：黃芪有擴張冠狀動脈血管、抗心肌缺氧及缺血/再灌注所致?lián)p傷，可改善心肌代謝，降低能量消耗，維持氧的供求平衡，提高心肌耐缺氧能力，保護(hù)心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，降低血黏度，有單用黃芪治療冠心病取得較好療效，可改善預(yù)后、預(yù)防復(fù)發(fā)。三棱可改善微循環(huán)，抗凝、抗血小板聚集，降低血液黏度。薤白具有抗單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附的作用，其機制可能是通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)，降低血漿內(nèi)皮素(ET)水平，升高血漿一氧化氮(NO)濃度，降低血脂和促進(jìn)血小板活化有關(guān)。

本研究結(jié)果表明：冠脈寧口服液可降低ApoE-/-小鼠的血脂及血清中visfatin及IL-6水平，減少動脈粥樣硬化斑塊面積，降低血管狹窄度，其可能通過調(diào)節(jié)血脂代謝、降低炎癥細(xì)胞因子水平達(dá)到抑制動脈粥樣硬化進(jìn)展、穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊的目的，其調(diào)控炎癥反應(yīng)的具體分子機制值得今后進(jìn)一步的研究。

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(本文編輯郭懷印)

Experimental Research of Guanmaining Oral Liquid on Atherosclerosis in Apolipoprotein E Gene Knockout Mice

Luo Wen，Zhang Sanlin

Xinxiang Medical University，Xinxiang 453000，Henan，China Corresponding Author：Zhang Sanlin

Objective To explore the effects and its mechanisms of Guanmaining oral liquid (GOL) on atherosclerosis(AS) in apolipoprotein E gene knockout mice(ApoE-/- mice).Methods Totally 30 C57BL/6J genetic background ApoE-/- mice which were 10 weeks old were fed a high fat diet for 12 weeks until the formation of a mature atherosclerotic plaque.They were randomly divided into three groups:model group，GOL group，compound salvia miltiorrhiza group，10 mice in each group.Another 10 wild-type normal C57BL/6J mice were used as the blank control group.They were administered for 12 weeks.Blood was extracted from the bulbus oculis.The serum lipid contents were observed with enzyme method.visfatin and interleukin-6 (IL-6) level were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).HE-stain was used to observe aortic pathomorphological changes.Results The blank control group showed no distinctive changes of atherosclerosis，the model group had distinctive increase of aortic intima thickness and atherosclerotic plaque formation.The model group also had high serum levels of total cholesterol(TC)，triglyceride(TG)and low-density lipoprotcin(LDL)，as well as high visfatin and IL-6 expression .However，high-density lipoprotein(HDL)in the model group was lower than the blank control group(all P<0.05).Compared with the model group，the serum levels of TC，TG，LDL-C were decreased.Visfatin and IL-6 expression were lowered(P<0.05)，while HDL-C was increased(P<0.05)in Guan maining group and compound salvia miltiorrhiza group，degree of pathological damage was reduced.There was no significant difference in above-mentioned indicators between GOL group and compound salvia miltiorrhiza group(P>0.05).Conclusion GOL could decrease the serum levels and the expression of visfatin and IL-6 of ApoE-/-mice.It can inhibit the development of atherosclerosis by regulating serum lipids，suppressing inflammation factors，which is the possible mechanism of stabilizing the atherosclerotic plaque.

atherosclerosis；apolipoprotein E gene knockout mice；visfatin；interleukin-6；Guanmaining oral liquid

河南省重點科技攻關(guān)計劃項目(No.132102310408)

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院(河南新鄉(xiāng) 453000)

張三林，E-mail：zsl196293@163.com

R543.5 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.19.010

1672-1349(2016)19-2240-04

2016-02-09)

引用信息：羅文，張三林.冠脈寧口服液干預(yù)ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的實驗研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2016，14(19)：2240-2243.