陳文君，劉其鋒，葉建明，李莎莎，郁麗霞，顧曉霞，董曉紅

（江蘇省昆山市第一人民醫(yī)院，1.腎臟內(nèi)科，2.臨床實驗研究中心，江蘇昆山215300）

老年腎臟病患者血清Klotho水平與腎功能不全關(guān)系的研究

陳文君1，劉其鋒1，葉建明1，李莎莎2，郁麗霞1，顧曉霞1，董曉紅1

（江蘇省昆山市第一人民醫(yī)院，1.腎臟內(nèi)科，2.臨床實驗研究中心，江蘇昆山215300）

目的 探討老年慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）患者血清Klotho水平變化與腎功能不全的關(guān)系及影響因素。方法 收集我院CKD患者100例，根據(jù)年齡分為老年組41例（年齡65≥歲）及非老年組59例（年齡＜65歲）、匹配健康對照組30例，采用ELISA法分別檢測三組受試者血清Klotho水平，并進一步分析其與腎功能不全的關(guān)系及影響因素。結(jié)果 CKD組血清Klotho水平明顯低于對照組；其中，老年CKD組血清Klotho水平又明顯低于非老年組（P＜0.05）；在排除腎功能的影響后，老年組血清Klotho水平仍然低于非老年組，差異有統(tǒng)計學意義；Pearson相關(guān)分析顯示，老年患者血清log Klotho水平與血鈣、體重、血色素、GFR呈正相關(guān)，與年齡、log FGF-23、log Scr、血磷呈負相關(guān)；多元逐步回歸分析顯示，年齡、log FGF-23、log Scr是影響老年組患者血清log Klotho水平的獨立危險因素。結(jié)論 CKD患者血清Klotho水平下降，其中老年組患者Klotho水平的較非老年組減少更明顯，Klotho的減少可能參與了老年CKD的發(fā)生發(fā)展。

老年； 慢性腎臟??； Klotho； 腎功能不全

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）目前已經(jīng)成為全球性的公共衛(wèi)生問題，且隨著年齡的增加，CKD的患病率也明顯升高［1］。CKD也是老年患者繼糖尿病、高血壓、心臟病外的另一個重要的致死致殘原因［2］。老年CKD患者的早期發(fā)現(xiàn)，及時治療是老年CKD防治的關(guān)鍵，同時對于老年CKD發(fā)病機制的研究也是臨床關(guān)注的重點。Klotho基因是新近被發(fā)現(xiàn)的抗衰老基因，其表達缺失可以引起動物表現(xiàn)出與人類衰老相似的臨床表現(xiàn)。Klotho主要表達在腎組織，腎臟病變時Klotho的表達明顯下降［3］，與CKD的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但關(guān)于血清Klotho水平與老年CKD患者腎功能不全的關(guān)系，目前研究不多。本研究采用ELISA技術(shù)檢測100例CKD患者（包括41例老年CKD患者，年齡≥65歲；59例非老年CKD患者，年齡＜65歲）及30例健康對照者血清Klotho水平，分析其與腎功能不全的關(guān)系及影響因素，探討老年CKD患者血清Klotho水平的變化及特點。

材料和方法

1 一般資料

收集我院腎內(nèi)科CKD患者共100例，其中年齡≥65歲的患者41例，年齡＜65歲的患者59例，同時匹配健康體檢者30例。采用MD及GC公式分別計算Ccr，取其平均值作為腎小球濾過率估計值（estimated glomerular filtration rate，eGFR）結(jié)果。根據(jù)改善全球腎臟病預后組織（KDIGO）2013指南標準，確診的CKD患者。同時需要符合以下條件：腎臟病史均超過三個月，且病情穩(wěn)定。排除標準：近期內(nèi)（3個月）腎功能損害急性加重，或各種原因?qū)е碌募毙阅I損傷；合并各種急、慢性炎癥；腫瘤患者。

老年CKD組共收集41例，平均年齡74.0±6.8歲，其中男22例，女19例，原發(fā)病中，慢性腎炎23例，糖尿腎病9例，高血壓性腎病4例，狼瘡性腎炎2例，其他3例。

非老年CKD組共收集59例，平均年齡46.7± 12.9歲，其中男35例，女24例，原發(fā)病中，慢性腎炎33例，糖尿腎病14例，高血壓性腎病5例，狼瘡性腎炎3例，其他4例。

健康對照組30例，平均年齡45.3±12.9歲，其中男17例，女13例，經(jīng)體檢明確排除CKD、急性腎損害、感染、腫瘤等合并癥。

若老年組與非老年組 CKD患者處于不同 CKD分期時，為了平衡腎功能在兩組間的影響，本研究進一步匹配非老年組中腎功能與老年組處于相同CKD分期的患者進一步對比分析。

2 研究方法

收集研究對象的一般資料，如年齡、性別、體重，CKD患者的原發(fā)病、CKD病史，用藥史；所有研究對象均于晨起抽取肘靜脈血，采用ELISA法檢測血清Klotho、FGF-23蛋白的水平（上海盈公酶聯(lián)檢測試劑有限公司），儀器為Spectra Max?340PC連續(xù)波長酶標儀（美國Molecular Devices公司）；全自動生化分析儀（美國Beckman公司）檢測血紅蛋白、血清尿素氮（Bun）、血清肌酐（Scr）、血白蛋白、血磷、血鈣水平。

3 統(tǒng)計學處理

計量資料采用均數(shù)±標準差形式表示，兩組間的計量資料采用t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用中位數(shù)及四分位間距（Q1，Q3）表示，并采用非參數(shù)檢驗；Pearson相關(guān)及多元逐步回歸用于分析影響血清Klotho水平的危險因素（其中FGF23、Klotho、Scr等使用log轉(zhuǎn)換，使其接近正態(tài)分布）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。使用SPSS22.0統(tǒng)計軟件分析結(jié)果。

結(jié)果

1 對照組與CKD組一般情況的比較

與對照組比較，CKD組患者年齡、血清Scr、Bun、血磷、FGF-23等水平均明顯升高，而血色素（Hb）、血鈣（P）、血白蛋白（Alb）、Klotho水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）具體見表1。

表1　一般情況比較（±s）

表1　一般情況比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05

分組對照組（n=30）CKD組（n=100）ACEI/ARB/23/100維生素D/67/100年齡（歲）45.3±12.957.11±17.2*Scr（μmol/L）82.9±16.4353.6±180.8*Bun（mmol/L）5.7±1.415.7±13.2*Hb（g/L）145.4±12.9107.4±26.8*Ca（mmol/L）2.45±0.192.13±0.20*P（mmol/L）0.96±0.431.47±0.51*Alb（g/L）45.9±1.932.8±6.8*FGF-23（pg/mL）298.95（257.81，364.51）428.44（322.00，676.53）*Klotho（ng/mL）9.81（7.45，12.2）2.97（1.75，5.23）*

2 老年組與非老年組CKD患者的比較

與非老年組比較，老年組患者血P、Scr、Bun、血FGF-23不同程度升高，而Ca、Alb及Klotho水平則不同程度降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），具體見表2。

表2　老年與非老年組CKD患者的比較（±s）

表2　老年與非老年組CKD患者的比較（±s）

注：與非老年組比較，*P＜0.05

項目老年組（n=41）非老年組（n=59）ACEI/ARB8/3915/61維生素D27/3940/61年齡（歲）74.03±6.78*46.74±12.89 Scr（μmol/L）399.77±457.15*301.76±201.75 Bun（mmol/L）15.74±13.54*11.29±6.17 Hb（g/L）98.78±22.59112.67±28.03 Ca（mmol/L）1.71±0.16*2.14±0.21 P（mmol/L）1.57±0.56*1.30±0.35 Alb（g/L）30.74±6.65*34.12±6.74 FGF-23（pg/mL）483.57（368.44，648.41）*426.73（307.52，750.21）Klotho（ng/mL）2.02（1.71，3.03）*4.30（1.89，6.92）

3 老年組與非老年組腎功能與血清Klotho水平的關(guān)系

與非老年組比較，老年組患者血清Klotho水平降低明顯，并伴隨血清FGF-23水平明顯升高明顯；非老年組則相反，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；同時發(fā)現(xiàn)，老年組患者腎功能處于CKD3期，非老年組為CKD4期，老年組患者腎功能較差，具體見表3。

表3　老年與非老年患者腎功能與血清Klotho關(guān)系（不同CKD分期，±s）

表3　老年與非老年患者腎功能與血清Klotho關(guān)系（不同CKD分期，±s）

注：與非老年組比較，*P＜0.05

分組GFR1GFR2平均GFRKlothoFGF-23老年組（n=41）25.2±19.3*28.8±22.5*27.0±20.9*2.02（1.71，3.03）*483.57（368.44，648.41）*非老年組（n=59）54.0±43.851.1±45.452.5±44.24.30（1.89，6.92）426.73（307.52，750.21）

腎功能會影響Klotho的表達，為了減少腎功能對Klotho表達水平的影響，本研究繼續(xù)選取兩組中腎功能相匹配的患者各30例，觀察兩組間相關(guān)指標的變化。結(jié)果顯示老年組患者血清Klotho水平仍然低于非老年組，血清FGF-23仍然高于非老年組（P＜0.05），具體見表4。

表4　老年與非老年患者腎功能與血清Klotho關(guān)系（相同CKD分期，±s）

表4　老年與非老年患者腎功能與血清Klotho關(guān)系（相同CKD分期，±s）

注：與非老年組比較，*P＜0.05

分組GFR1GFR2平均GFRKlothoFGF-23老年組（n=30）27.1±19.529.3±21.727.8±21.32.12（1.68，3.12）*489.76（360.47，661.52）*非老年組（n=30）31.0±26.327.6±23.329.2±22.13.80（1.76，6.65）434.51（311.41，780.32）

4 影響老年CKD患者血清Klotho表達水平的相關(guān)因素分析

Pearson相關(guān)分析顯示，血清log Klotho水平與血鈣、體重、血色素、GFR呈正相關(guān)，與年齡、log FGF23、log Scr、血磷呈負相關(guān)，見表5。多元逐步回歸分析顯示，年齡、log FGF-23、log Scr是影響血清log Klotho水平的獨立因素，回歸方程為Log Klotho =3.813-0.012×年齡-0.673×logFGF23-0.331×log Scr（標準化β值分別為-0.012、-0.673、-0.331，常數(shù)項為3.813，P＜0.05）。

表5　Log Klotho影響因素（Pearson相關(guān)分析）

討論

流行病學調(diào)查顯示，我國老年CKD的患病率可高達30%［4］，說明CKD已經(jīng)成為老年人的常見病之一。據(jù)報道，年齡每增加10歲，腎功能損害指標如蛋白尿的風險增加8%，腎功能不全的風險則增加74%，說明高齡確實是引起老年CKD患者腎功能惡化的一個危險因素［5］。高齡引起的腎功能不全除了與器官功能逐漸退化及老年人多合并高血壓、糖尿病、心血管疾患等傳統(tǒng)腎臟損害因素外，也可能與Klotho基因的表達減少有關(guān)［6］。

Klotho基因是Kuro等［7］在1997年研究自發(fā)性高血壓動物模型時偶然發(fā)現(xiàn)的，編碼Klotho蛋白，表達在腎臟，但甲狀旁腺及腦組織等也有少量表達。Klotho基因缺失的小鼠可以表現(xiàn)為類似人類衰老的一系列病理生理改變，如生長停滯、壽命縮短、骨質(zhì)疏松、血管鈣化、肺氣腫等，而Klotho基因的過表達則可以延長動物20%～30%的壽命［8］，證實了Klotho的抗衰老作用。研究表明，Klotho的抗衰老作用可能與其抗氧化、調(diào)節(jié)鈣磷代謝及抑制IGT-1信號通路等有關(guān)［8-10］。根據(jù)Klotho基因剪切的不同，其可以編碼膜型和分泌型兩種Klotho蛋白。膜型定位于細胞膜，主要功能是作為FGF-23的協(xié)同受體，參與機體對血磷的調(diào)節(jié)，故Klotho與FGF-23關(guān)系密切，因此本研究也檢測了血清FGF-23的水平；膜型Klotho的胞外區(qū)可以被水解脫落，隨循環(huán)作用于遠端靶器官發(fā)揮抗氧化、抗炎、抑制纖維化等作用，這部分稱之為分泌型Klotho?，F(xiàn)已證實，腎臟是Klotho的主要產(chǎn)生器官，其中腎小管上皮細胞是其主要表達細胞［9］。CKD往往伴隨腎小管的萎縮，因此不可避免地影響Klotho的生成，降低Klotho的表達，且腎功能越差，其減少越明顯［10］，其中膜型與分泌型Klotho的減少是一致的［11］。我們的結(jié)果也表明，CKD患者（包括老年與非老年）血清Klotho水平較健康對照組明顯降低，說明 CKD確實降低了 Klotho的表達。

Klotho基因是一種抗衰老基因，不難理解，其表達水平會隨著年齡的增長而逐漸下降。動物模型證實，老年大鼠腎組織Klotho mRNA及蛋白的表達較非老年大鼠明顯減少［12］；本研究結(jié)果也表明，老年CKD患者血清Klotho水平較非老年組降低1.1倍，在平衡腎功能的影響后，老年患者血清Klotho水平仍然較對照組降低0.88倍，這與Scholze等［10］的研究結(jié)果一致。相關(guān)分析也證實，Klotho的水平除了與腎功能有關(guān)外，年齡也是影響Klotho表達的一個主要因素，進一步印證了這種關(guān)系。但年齡如何降低Klotho的表達目前尚不明確，可能與以下因素有關(guān)：①高齡患者腎功能退化：研究表明，大于40歲的人群，腎臟的各種機能開始進行性下降，年齡每增加10歲，腎小球濾過率會下降8mL/min，其中男性下降更明顯［13］，腎功能的退化會必然導致Klotho的產(chǎn)生減少；②老年患者機體存在氧化應(yīng)激反應(yīng)，而氧化應(yīng)激干擾了 Klotho基因啟動子的活性，降低了Klotho的表達［14］；③老年患者Klohto的降低也可能與Klotho基因的多態(tài)性有關(guān)［15］。

Klotho的減少如何影響老年CKD的發(fā)生發(fā)展？現(xiàn)已證明，Klotho是新發(fā)現(xiàn)的腎臟保護因子，除了具有抗衰老作用外，還有抑制腎小管上皮細胞凋亡、抑制腎臟炎癥反應(yīng)、改善腎臟氧化應(yīng)激狀態(tài)及抑制腎間質(zhì)纖維化等細胞保護作用，Klotho的減少也被認為是CKD患者腎功能惡化的危險因素之一［16］。隨著年齡的增長，老年患者腎臟結(jié)構(gòu)與功能逐漸退化，腎臟Klotho的表達逐漸下降，Klotho的減少增強了多種致病因素如細胞凋亡、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激等引起的腎臟損傷，這可能是Klotho減少更易引起老年CKD的重要原因之一。

除了年齡以為，老年CKD患者Klotho表達水平也受血磷及FGF-23的影響。本研究表明，老年患者血清Klotho水平明顯降低的同時，伴隨血磷及FGF-23水平明顯升高，Klotho與血磷、FGF23呈負相關(guān)。FGF-23是新發(fā)現(xiàn)的調(diào)磷因子，通過抑制腎臟對磷的重吸收而降低血磷，但FGF-23需要在Klotho的“協(xié)同”作用下，才能發(fā)揮降低血磷的作用［17］。CKD患者由于腎單位的丟失，多伴有高磷血癥，從而刺激FGF-23的表達以降低血磷；隨著CKD的進展，高磷血癥也越明顯，由于腎組織Klotho的表達隨CKD的進展逐漸下降，導致CKD晚期高水平的FGF-23由于缺少Klotho的“協(xié)助”，并不能有效發(fā)揮降血磷作用，而高血磷則進一步刺激FGF-23的升高，這可能是CKD患者血清Klotho與血磷、FGF23呈負相關(guān)的機制。

另外，一些藥物如ACEI/ARB、活性維生素D也可能影響老年CKD患者Klotho的表達［18］，本研究中兩類藥物的使用在兩組之間均較少，且無差異，故尚不能排除此類藥物對老年患者血清Klotho表達的影響。

總之，CKD患者血清Klotho水平明顯降低，其中老年CKD組Klotho降低水平更明顯，Klotho的減少可能促進了老年CKD的發(fā)生發(fā)展。將來通過一些手段調(diào)節(jié)Klotho的表達，如藥物增加內(nèi)源性Klotho的表達或給予外源性Klotho替代治療，有可能成為CKD患者尤其是老年CKD患者防治的一個新靶點。

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（潘子昂編輯）

Correlation Between the Levels of Serum Klotho and Renal Insufficiency in
Elderly Patients with Chronic Kidney Disease

CHEN Wen-jun，LIU Qi-feng，YE Jian-ming，LI Sha-sha，YU Li-xia，GU Xiao-xia，DONG Xiao-hong
（Department of Nephrology，and Clinical Research&Lab Centre，the First People's Hospital of Kunshan，Kunshan 215300，China）

Objective To investigate the relationship between the levels of serum Klotho and kidney dysfunction in elderly patients with chronic kidney disease（CKD）.Methods Serum samples from 100 CKD patients，including 41 elderly CKD patients（≥65 years old）and 59 non-elderly CKD patients（＜65 year old）.There were 30 healthy volunteers（control group）enrolled.The serum of Klotho was detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.Results The levels of serum Klotho in CKD group was significantly lower than that in control group.The Klotho level in elderly CKD patients was much lower than that in non-elderly CKD group（P＜0.05）.When renal function was excluded，the Klotho level in elderly patients was still significantly reduced（P＜0.05）.Pearson correlation analysis showed that serum Klotho in elderly CKD patients was positively correlated with blood calcium，weight body，hemoglobin and estimated glomerular filtration rate（eGFR），while was negatively correlated with phosphate，age，log Scr and log FGF-23.Multiple regression analysis showed age，log Scr and log FGF-23 were independent factors for serum Klotho in elderly CKD patients.Conclusion Serum Klotho level in CKD patients was reduced and serum Klotho level in elderly CKD patients decreaseddramatically.Klotho deficiency may promote the development of renal dysfunction in elderly patients with CKD.

Elderly patients； Chronic kidney disease； Klotho； Renal insufficiency

10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.09.024

2016-04-06；

2016-06-04

陳文君，女，學士，主治醫(yī)師。E-mail：christa0512@163.com

董曉紅，女，副主任醫(yī)師。E-mail：dongxiaohong304@163.com