邵 婧，丁 宸，徐萍萍

（徐州市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，徐州221009）

艱難梭菌毒素A/B、BD-PCR毒素基因及GDH檢測(cè)對(duì)艱難梭菌相關(guān)性腹瀉的診斷價(jià)值

邵 婧，丁 宸，徐萍萍

（徐州市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，徐州221009）

目的 探討艱難梭菌毒素A/B及其相關(guān)毒素基因檢測(cè)對(duì)艱難梭菌相關(guān)性腹瀉的診斷價(jià)值。方法 收集2015年1月至2015年10月我院ICU病房腹瀉疑似艱難梭菌感染患者的糞便標(biāo)本133例作為研究對(duì)象，分別采用艱難梭菌培養(yǎng)法、CDAB法、PCR毒素基因檢測(cè)法及艱難梭菌毒素GDH檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)，以艱難梭菌培養(yǎng)法結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算各方法的診斷指標(biāo)所包含有的特異度、敏感度、陰性預(yù)測(cè)值和陽性預(yù)測(cè)值等。結(jié)果 本研究收集的133例糞便標(biāo)本中，經(jīng)過金標(biāo)準(zhǔn)糞便樣本厭氧培養(yǎng)法檢出陽性結(jié)果20例，陰性結(jié)果113例。CDAB法具有低敏感度（0.550）和高特異度（0.912），診斷符合率為0.932，BD-PCR毒素基因檢測(cè)法具有高敏感度（0.950）和高特異度（0.929），診斷符合率為0.932，艱難梭菌毒素GDH檢測(cè)法的高敏感度（0.900）和低特異度（0.779），診斷符合率為0.797。結(jié)論 對(duì)于疑似艱難梭菌感染，可聯(lián)合艱難梭菌GDH、艱難梭菌毒素A/B（CDAB）或進(jìn)行熒光定量PCR毒素基因共同檢測(cè)，有效降低檢測(cè)時(shí)間，為臨床醫(yī)師及時(shí)提供準(zhǔn)確的診斷依據(jù)，并制定行之有效的治療措施。

艱難梭菌毒素A/B； 毒素基因； 靈敏度； 診斷價(jià)值

艱難梭菌是一種厭氧性細(xì)菌，是引起抗菌藥物相關(guān)腹瀉及假膜性結(jié)腸炎的主要原因［1］。近年來，在醫(yī)院引發(fā)的艱難梭菌感染逐漸被人重視，早期艱難梭菌相關(guān)性腹瀉快速準(zhǔn)確的診斷對(duì)于有效預(yù)防及治療醫(yī)院微生物感染非常重要［2］。檢測(cè)艱難梭菌的金標(biāo)準(zhǔn)方法為細(xì)菌培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)毒素實(shí)驗(yàn)，其檢測(cè)條件較為苛刻，需專業(yè)性厭氧培養(yǎng)箱和組織培養(yǎng)條件，且操作復(fù)雜，檢測(cè)周期長(zhǎng)，難以在臨床推廣和普及［3］。為了探討艱難梭菌毒素A/B及其相關(guān)毒素基因檢測(cè)對(duì)艱難梭菌相關(guān)性腹瀉的診斷價(jià)值，本文以糞便樣本厭氧培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，選取2015年1月至2015年10月我院ICU病房133例腹瀉患者的糞便標(biāo)本，采用不用的檢測(cè)方法進(jìn)行研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

材料和方法

1 標(biāo)本來源

收集2015年1月至2015年10月我院ICU病房腹瀉疑似艱難梭菌感染患者的糞便標(biāo)本133例，其中65歲以上56例，50至65歲之間患者43例，50歲以下患者34例。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者在24h內(nèi)出現(xiàn)3次或3次以上腹瀉；糞便性狀為稀便、糊狀便或水樣便；腹瀉前3個(gè)月內(nèi)使用過抗生素。首先采集腹瀉患者的糞便作為檢測(cè)標(biāo)本，并將標(biāo)本置于干凈無防腐劑的無菌杯中，在2～8℃環(huán)境中保存，24 h內(nèi)檢測(cè)。每例患者留取2份標(biāo)本，一份進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，另一份進(jìn)行艱難梭菌GDH、艱難梭菌毒素A/B（CDAB）、熒光定量PCR毒素基因檢測(cè)。

2 試劑和儀器

細(xì)菌培養(yǎng)所需的厭氧培養(yǎng)基、厭氧產(chǎn)氣劑、ANC鑒定卡以及細(xì)菌鑒定儀VITEK2等購買于法國生物梅里埃公司；采用酶聯(lián)熒光測(cè)定法（ELFA）檢測(cè)艱難梭菌毒素A/B（CDAB），CDAB檢測(cè)試劑盒及VIDAS分析儀均來自法國生物梅里埃公司；采用PCR法檢測(cè)CDAB毒素基因，檢測(cè)試劑盒購買于美國BD公司，PCR擴(kuò)增儀型號(hào)為ABI 9700型（美國）。

3 方法

對(duì)所有標(biāo)本進(jìn)行編號(hào)，同時(shí)進(jìn)行艱難梭菌毒素A/B（CDAB）檢測(cè)、艱難梭菌培養(yǎng)、艱難梭菌毒素GDH及PCR毒素基因檢測(cè)。

3.1艱難梭菌培養(yǎng) 挑取適量糞便標(biāo)本于肉湯中充分震蕩混勻后接種于厭氧培養(yǎng)基和艱難梭菌選擇性培養(yǎng)基（CCFA），于35℃厭氧環(huán)境持續(xù)培養(yǎng)5d，每天都對(duì)菌落生長(zhǎng)情況進(jìn)行仔細(xì)觀察，根據(jù)艱難梭菌菌落形態(tài)以及革蘭染色鏡下典型形態(tài)進(jìn)行鑒別，使用梅里埃ANC鑒定卡進(jìn)行鑒定。

3.2艱難梭菌毒素A/B（CDAB）檢測(cè) 采用兩步夾心法與終點(diǎn)熒光檢測(cè)相結(jié)合的酶聯(lián)免疫熒光法技術(shù)（ELFA）。取均一化的糞便標(biāo)本200μL于1000μL樣本稀釋液中充分混勻，離心時(shí)間設(shè)置為5min。每個(gè)CDAB SPR與CDAB試劑條對(duì)應(yīng)每份質(zhì)控品與標(biāo)本。將300μL標(biāo)本上清液加入標(biāo)本孔中，于固相管（SPR）內(nèi)外數(shù)次循環(huán)反應(yīng)液，每步反應(yīng)后開始對(duì)循環(huán)進(jìn)行清洗有利于未結(jié)合成分的去除。在4個(gè)檢測(cè)步驟自動(dòng)完成后，儀器自動(dòng)分析結(jié)果。結(jié)果判讀：按照試劑盒說明書，檢測(cè)值＜0.3，為陰性結(jié)果；0.13～0.37，為可疑陽性；≥0.37，為陽性結(jié)果。

3.3BD-PCR毒素基因檢測(cè)［4］采用實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國ABI 9700），BD Gene Ohm實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒購買自美國BD公司。將較多的樣本蘸取于無菌干棉棒上，并懸于樣本緩沖液中進(jìn)行充分混合，然后取10μL加入至裂解緩沖液中進(jìn)行核酸的提取。將試劑混合物（包含內(nèi)質(zhì)特異性探針與毒素B基因）與裂解液（3μL）混合加入至專用的試管中，并使用PCR擴(kuò)增儀完成DNA擴(kuò)增，在每次擴(kuò)增過程中，均包含陽性與陰性質(zhì)控。對(duì)于擴(kuò)增的DNA靶序列，分別使用針對(duì)性的分子信標(biāo)進(jìn)行標(biāo)記。

3.4艱難梭菌毒素GDH檢測(cè)［5］艱難梭菌毒素GDH采用膠體金法檢測(cè)，檢測(cè)卡由德國Nadal公司提供。檢測(cè)前，先用稀釋液對(duì)糞便樣品進(jìn)行稀釋，再加入4滴糞便稀釋液于檢測(cè)卡上，若樣本中含有GDH，檢測(cè)卡會(huì)顯示出紅色。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

檢測(cè)結(jié)果用SPSS20.0軟件進(jìn)行分析處理。以艱難梭菌培養(yǎng)法為判定艱難梭菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算各方法的特異度、敏感度、陰性預(yù)測(cè)值和陽性預(yù)測(cè)值等診斷指標(biāo)。

結(jié)果

1 三種檢測(cè)方法與金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)結(jié)果

本研究收集的133例糞便標(biāo)本中，經(jīng)過金標(biāo)準(zhǔn)糞便樣本厭氧培養(yǎng)法檢出陽性結(jié)果40例，陰性結(jié)果93例；CDAB檢測(cè)陽性樣品為21例，陰性樣品為112例；PCR方法檢測(cè)陽性樣品為27例，陰性樣品為106例（圖1）；GDH方法檢測(cè)陽性樣品為43例，陰性樣品為90例（圖2）。結(jié)果見表1。

表1　CDAB，PCR及GDH檢測(cè)與金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)結(jié)果的比較

2 三種檢測(cè)方法結(jié)果診斷學(xué)指標(biāo)

PCR毒素基因方法在敏感性、特異性方面顯著優(yōu)于CDAB和艱難梭菌毒素GDH（P＜0.001），在診斷符合率方面CDAB和PCR毒素基因均顯著優(yōu)于艱難梭菌毒素GDH（P＜0.05），結(jié)果見表2。

表2　三種檢測(cè)方法結(jié)果診斷學(xué)指標(biāo)的比較

討論

臨床上抗生素相關(guān)腹瀉與艱難梭菌緊密相關(guān)，該細(xì)菌感染具有非特異性表現(xiàn)，病情較輕時(shí)僅為自限性腹瀉，嚴(yán)重情況下可出現(xiàn)中毒性巨結(jié)腸與偽膜性腸炎［6］。全球流行病學(xué)研究結(jié)果表明，艱難梭菌感染發(fā)病率、復(fù)發(fā)率、病死率（尤其在北美與歐洲）呈急劇上升趨勢(shì)［7］。另外，該疾病在社區(qū)也具有較高的發(fā)病率。然而，由于缺乏較好的診斷方法，使得目前艱難梭菌感染的診斷特異性差、敏感性低、周期長(zhǎng)，且要求技術(shù)也較高［8］。

艱難梭菌是一種嚴(yán)格的專性厭氧菌，用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的厭氧培養(yǎng)法非常困難?，F(xiàn)有的檢測(cè)艱難梭菌的方法有、厭氧培養(yǎng)法、酶聯(lián)免疫法、PCR檢測(cè)及GDH檢測(cè)等。其中組織培養(yǎng)細(xì)胞毒素試驗(yàn)和糞便標(biāo)本厭氧培養(yǎng)是檢測(cè)艱難梭菌的金標(biāo)準(zhǔn)，但這兩種檢測(cè)方法花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，經(jīng)濟(jì)成本大，同時(shí)操作復(fù)雜，難以在臨床應(yīng)用中推廣［9］。PCR檢測(cè)法具有較高的特異度與靈敏度，同時(shí)花費(fèi)時(shí)間短，簡(jiǎn)單易操作，唯一缺點(diǎn)是經(jīng)濟(jì)成本較大。GDH檢測(cè)是近年來檢測(cè)艱難梭菌的一種新方法，其敏感度較高，操作快捷簡(jiǎn)單。酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法是目前比較成熟且應(yīng)用較為廣泛的檢測(cè)方法，不僅操作簡(jiǎn)潔，成本較低，可與GDH檢測(cè)聯(lián)合應(yīng)用［10］。

本文133例腹瀉患者中有20例糞便標(biāo)本檢出艱難梭菌，陽性率15.0%（20/133）。本文研究結(jié)果表明相比于金標(biāo)準(zhǔn)艱難梭菌培養(yǎng)法，酶免疫學(xué)法CDAB法雖然具有高特異度（0.912），具但敏感度（0.550）較低，因此酶免疫法不宜單獨(dú)用于臨床檢測(cè)艱難梭菌。艱難梭菌毒素GDH檢測(cè)法雖具有高敏感度（0.900），但特異度較低（0.779），可與酶免疫學(xué)法CDAB聯(lián)合使用。其中BD-PCR毒素基因檢測(cè)法效果最佳，具有高敏感度（0.950）和高特異度（0.929）。

綜上所述，疑似艱難梭菌相關(guān)性腹瀉患者在沒有培養(yǎng)出致病菌的情況下，可采用多個(gè)實(shí)驗(yàn)技術(shù)相結(jié)合的方法，先檢測(cè)艱難梭菌GDH，用于細(xì)菌定植篩查GDH。再檢測(cè)艱難梭菌毒素A/B（CDAB）或進(jìn)行熒光定量PCR毒素基因檢測(cè)，用于毒素確認(rèn)診斷。以上方法可大大降低檢測(cè)時(shí)間，為臨床醫(yī)師及時(shí)提供準(zhǔn)確的診斷依據(jù)，并制定行之有效的治療措施。同時(shí)能及時(shí)報(bào)告艱難梭菌院內(nèi)爆發(fā)，促進(jìn)感控措施，減輕患者痛苦，降低死亡率。

［1］嚴(yán)其容，李文革，許文榮，等.25株艱難梭菌多位點(diǎn)序列分型.臨床檢驗(yàn)雜志，2012，30（3）：183-186.

［2］姜國俊，王學(xué)艷，張曼，等.腹瀉型腸易激綜合征患者食物特異性IgG抗體的檢測(cè)及意義.標(biāo)記免疫分析與臨床，2008，15（6）：402-403.

［3］張春瑩，康梅，何超，等.艱難梭菌腹瀉及實(shí)驗(yàn)室診斷.寄生蟲病與感染性疾病，2012，10（2）：68-72.

［4］周麗民，雷永良，王小光，等.實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)在致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用.標(biāo)記免疫分析與臨床，2012，19（5）：296-299.

［5］劉元元，劉文恩，簡(jiǎn)子娟，等.住院腹瀉患者艱難梭菌檢測(cè)與分析.中國感染控制雜志，2012，11（4）：293-296，299.

［6］吳微珍.艱難梭菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的比較.浙江大學(xué)，2012：31-32.

［7］孫立穎，黃磊，嚴(yán)巖，等.酶聯(lián)熒光免疫分析技術(shù)檢測(cè)糞便中艱難梭菌毒素A/B.臨床檢驗(yàn)雜志，2012，30（2）：95-97.

［8］楊雪妹，吳允孚.艱難梭菌的生物學(xué)特性與實(shí)驗(yàn)室診斷.中國感染與化療雜志，2013，13（3）：232-234.

［9］Gallegos-Orozco J F，Paskvan-Gawryletz C D，Guradu S R，et al. Successful colonoscopic fecal transplant for severe acute clostridium difficile pseudomembranous colitis.Rev Gastroenterol Mex，2012，77（1）：40-42.

［10］唐海先，肖洪廣，楊玉靜，等.腹瀉患者艱難梭菌的檢測(cè)及分析.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2013，23（17）：3328-3231.

（潘子昂編輯）

Detection of Clostridium Botulinum Toxin A/B，BD-PCR Toxin Gene and GDH in the Diagnosis of Clostridium Botulinum Associated Diarrhea

SHAO Jing，DING Chen，XU Ping-ping
（Department of Clinical Laboratory，Central Hospital of Xuzhou，Xuzhou 221009，China）

Objective To study the diagnostic value of Clostridium Botulinum toxin A/B and its associated toxin gene in the diagnosis of Clostridium Botulinum associated diarrhea.Methods A total of 133 patients with diarrhea stool specimens suspected having Clostridium difficile infection were selected as the research objects.Clostridium difficile culture method for stool specimens，Clostridium difficile toxin A/B（CDAB），PCR toxin gene detection，and Clostridium difficile toxin GDH detection were used for the study.We took Clostridium difficile culture as a gold standard and calculated sensitivity，specificity，positive/negative predictive value for each method.Results Out of 133 cases stool specimens，20 cases were positive for Clostridium difficile infection，113 cases were negative based on the gold standard of stool samples anaerobic culture.The CDAB method had low sensitivity（0.550）and high specificity（0.912），the diagnostic accordance rate was 0.932.BD-PCR toxin gene detection method had high sensitivity（0.950）and high specificity（0.929），the diagnostic accordance rate was 0.932.Clostridium difficile toxin GDH detection method had high-sensitivity sense（0.900）and low specificity（0.779），diagnostic coincidence rate was 0.797.Conclusion Clostridium difficile GDH can be combined with Clostridium difficile toxin A/B（CDAB）or PCR toxin gene detection for suspected Clostridium difficile infection.It can effectively reduce the detection time，provide accurate diagnosis for clinicians in order to develop effective treatment measures.

Clostridium botulinum toxin A/B； Toxin Gene； Sensitivity； Diagnostic value

10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.09.013

2016-03-27；

2016-04-14

徐萍萍。