劉乙雨+曾從濤+吳金芋+樊汶樵

摘要：胰島素樣生長因子-2（IGF-2）是介導生長激素發(fā)揮生物學功能的重要因子，在動物機體的生長發(fā)育中具有重要作用。為對黑斑蛙IGF-2基因進行原核表達，本研究針對轉錄組數(shù)據(jù)中的黑斑蛙IGF-2序列，設計引物擴增IGF-2的完整基因，獲得了全長為944 bp、ORF長為651 bp的序列；隨后在黑斑蛙IGF-2的ORF兩端添加限制性內(nèi)切酶位點后亞克隆到pET-32a（+）質(zhì)粒中，構建了黑斑蛙IGF-2的原核表達載體。為獲得黑斑蛙IGF-2的表達產(chǎn)物并探究其生物學作用奠定了基礎。

關鍵詞：黑斑蛙；胰島素樣生長因子-2；表達載體構建

中圖分類號：S855.1 文獻標識碼：B 文章編號：1007-273X（2016）08-0005-02

胰島素樣生長因子-2（insulin -like growth factors Ⅱ，IGF-2），又稱生長調(diào)節(jié)素A，是一個單鏈多肽分子，與胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factorsⅠ，IGF-1）在氨基酸組成上具有同源性，并且二者都與胰島素原（proinsulin）具有同源性[1]，故此得名。IGF-2是一個在細胞增殖、分化、程序性細胞死亡和轉化中具有重要作用的因子，對個體生長、發(fā)育具有重要作用[2]。

黑斑蛙（Rana nigromaculata）俗稱“青蛙”、“田雞”；隸屬于兩棲綱、無尾目、蛙科；是我國分布最廣的兩棲動物之一，也具有較高的商業(yè)價值[3]。主要生活于海拔1 000 m以下的平原丘陵地區(qū)，多棲息于稻田、菜園、池塘、山溝等地；對環(huán)境適應性極強。本研究以黑斑蛙為研究對象，對黑斑蛙IGF-2基因進行克隆并構建原核表達載體，為下一步獲得其表達產(chǎn)物及生物學功能鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

黑斑蛙生長在重慶珍稀瀕危水產(chǎn)資源保護與開發(fā)研究中心的流水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，挑選健康的成蛙，采用雙毀髓法處死后取其肝臟組織，立即放入液氮中保存。

Trizol購自上海生工，Taq酶、pGEM-T質(zhì)粒購自Promega公司，高純質(zhì)粒小量快速提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收及純化試劑盒購自博邁德生物公司，感受態(tài)BL21（DE3）購自北京天根生化有限公司，XhoⅠ、BamH I 購自大連寶生物公司，酵母提取物、蛋白胨、Agar購自OXOID公司，pET-32a（+）由本室保存?zhèn)溆?。氨芐青霉素50 mg/mL為本室自己保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據(jù)轉錄組數(shù)據(jù)庫中IGF-2序列的保守區(qū)，利用Primer 5.0軟件，設計一對特異性擴增引物（上游引物：5′-GCAACATCCAGC

AATACCACAGACGA-3′，下游引物： 5′-CTTTGGTG

TCTCAGTTTGCTCGTTT-3′）。引物并交由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.2 cDNA制備 取液氮中保存的黑斑蛙肝臟。根據(jù)Trizol試劑盒說明書進行總RNA的提取，并利用Promega公司的cDNA合成試劑盒說明書完成cDNA的制備。

1.2.3 PCR擴增 利用高保真DNA Taq酶進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用凝膠回收試劑盒進行回收。陽性產(chǎn)物送蘇州金唯智生物科技有限公司測序。

1.2.4 IGF-2亞克隆引物設計 為了使IGF-2與pET-32a（+）質(zhì)粒相連，在IGF-2片段上、下游引物分別引入BamH I和Xho I等限制性內(nèi)切酶的識別位點并設計特異性引物（上游引物：5′-CGCGGATCC

ATGGAGCAACTAAGATGCAAAACCA-3′；下游引物：5′-GGCGAGCTCTCAATTATGGGAGGACTCTGA GTCT-3′）。引物交由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.5 表達載體的構建 對1.2.3中獲得的IGF-2全基因片段用高保真DNA Taq酶進行PCR擴增。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用瓊脂糖凝膠回收及純化試劑盒回收，用BamH I和Xho I對擴增的IGF-2片段與pET-32a（+）質(zhì)粒分別進行雙酶切，酶切產(chǎn)物使用T4DNA連接酶連接并轉化大腸桿菌BL21（DE）。陽性重組子用高純質(zhì)粒小量快速提取試劑盒提取質(zhì)粒，并進行雙酶切鑒定；酶切結果送蘇州金唯智生物科技有限公司測序鑒定。

2 結果

2.1 IGF-2全基因序列克隆結果

從黑斑蛙肝臟cDNA中克隆到約950 bp大小的基因片段，與預期產(chǎn)物一致，電泳結果見圖1。該片段包含IGF-2基因全序列，包含651 bp的完整ORF。

2.2 IGF-2原核表達載體構建結果

由圖2可知，提取的陽性重組質(zhì)粒子經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切后，出現(xiàn)約700 bp和5 900 bp的片段，與預期結果一致。

3 討論

動物GH/IGF軸相關激素的效應對于機體生長發(fā)育具有至關重要的作用，其效應模式主要是由多種因子和多種調(diào)控模式組成了GH合成與分泌的調(diào)控網(wǎng)絡。在該模式中，GH處于上游位置，而IGF 則處于下游位置，直接作用于靶細胞，介導GH 的生物效應[4]。其中，IGF-2的作用主要體現(xiàn)在加快細胞周期進程、調(diào)控細胞增殖、增加DNA的合成能力和血管的合成能力[5]。目前已經(jīng)證明IGF-2與瘦肉率、脂肪積淀等許多經(jīng)濟性狀有關[6]。近年來IGF-2與多種疾病的關系已經(jīng)引起了極大關注，相信隨著對其研究的深入，將有助于人類控制自身的疾病，也能為臨床診斷、治療帶來新思路[7]。

目前關于IGF-2的研究多在于哺乳動物，兩棲類IGF-2報道很少，有鑒于此，本實驗以黑斑蛙IGF-2為研究對象，獲得了陽性重組質(zhì)粒。為下一步探究IGF-2在pET-32a（+）質(zhì)粒中最優(yōu)表達條件的篩選、表達產(chǎn)物的生物學活性測定奠定了基礎；也為黑斑蛙IGF-2的臨床應用提供了參考。

參考文獻：

[1] POLLAK M. The insulin and insulin-like growth factor receptor family in neoplasia：an update[J].Nat Rev Cancer，2012，12（3）：159-169.

[2] PERRINI S，LAVIOLA L，CARREIRAM C，et al. The GH/IGFⅠ axis and signaling pathways in the muscle and bone： mechanisms underlying age-related skeletal muscle wasting and osteoporosis[J]. J Endocrinol，2010，205（3）：201-210.

[3] 費 梁，葉昌媛，黃永昭，等.中國兩棲動物檢索及圖解[M].成都：四川科學技術出版社，2005.

[4] CANOSA L F，CHANG J P，PETER R E. Neuroendocrine control of growth hormone in fish[J].Gen Comp Endocr，2007，151（1）：1-26.

[5] 彭鳳蘭.胰島素生長因子2（Igf2）研究進展[J].實用預防醫(yī)學， 2007，14（6）：1963-1966.

[6] 王丁科，閻 萍，梁春年，等.胰島素樣生長因子2研究進展[J].動物醫(yī)學進展，2008，29（7）：67-70.

[7] 朱 嬋.IGF2的生物學特性及其與疾病關系的研究進展[J].國際檢驗醫(yī)學雜志，2010，31（9）：966-969.