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        代謝組學(xué)技術(shù)及其在針灸臨床療效機(jī)制研究中的進(jìn)展

        2016-11-19 12:46:19陳勤吳巧鳳方劍喬
        關(guān)鍵詞:代謝組學(xué)作用機(jī)制針灸

        陳勤 吳巧鳳 方劍喬

        【摘要】 代謝組學(xué)是一種具有整體研究功能的組學(xué)研究方法,在針灸學(xué)機(jī)制研究中具有良好前景。隨著針灸臨床療效機(jī)制研究與代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合的不斷深入,尋求一種符合代謝組學(xué)研究方法并兼顧針灸效應(yīng)特點(diǎn)的研究策略顯得尤為重要。筆者對近10年針灸代謝組學(xué)研究進(jìn)展進(jìn)行分析,并提出針灸臨床療效研究與代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合的幾點(diǎn)建議。

        【關(guān)鍵詞】 代謝組學(xué); 針灸; 作用機(jī)制; 針灸現(xiàn)代化

        Progress of Research on the Technology of Metabolism in Acupuncture and Moxibustion/CHEN Qin, WU Qiao-feng, FANG Jian-qiao.//Medical Innovation of China,2016,13(04):138-141

        【Abstract】 Metabonomics is a kind of whole function research group study method, which has a good prospect in the research of the mechanism of acupuncture and moxibustion. Along with the deepening of clinical therapeutic effect of acupuncture and moxibustion on the mechanism and metabolic omics technologies combined with and seek a meet the metabonomics research methods and taking into account the effect characteristics of acupuncture and moxibustion research strategy is particularly important. The author of nearly 10 years the metabolism of acupuncture and moxibustion group research analysis, and put forward the clinical therapeutic effect of acupuncture and moxibustion research and metabolic group science and technology combined with some suggestions.

        【Key words】 Metabolism; Acupuncture and moxibustion; Mechanism study; Modernization of acupuncture and moxibustion

        First-authors address: The Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310005, China

        doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2016.04.040

        代謝組學(xué)(Metabonomics)是上個世紀(jì)末繼基因組學(xué)(Genomics)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)(Transcriptomics)、蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)之后發(fā)展起來的一門新的組學(xué)[1-2]。其基本定義“在生物體新陳代謝的動態(tài)進(jìn)程中,通過系統(tǒng)分析生物的體液、組織中的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物譜的變化,來系統(tǒng)研究生物體整體受到外部刺激后的生物狀況和調(diào)節(jié)功能”。近年來,與診斷學(xué)、藥(毒理)學(xué)相關(guān)的代謝組學(xué)研究發(fā)展較快,其中具有代表性的有腫瘤、心血管疾病早期診斷,糖尿病發(fā)病因素研究,遺傳性疾病研究等[3-7]。

        近10年來,國內(nèi)學(xué)者將代謝組學(xué)研究手段引入針灸研究領(lǐng)域,并利用代謝組學(xué)技術(shù)對消化系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、風(fēng)濕免疫性疾病等針灸臨床常見疾病的針灸療效代謝機(jī)制進(jìn)行初步研究。本文對近10年代謝組學(xué)在針灸學(xué)研究中的進(jìn)展進(jìn)行綜述,并提出自己的見解。

        1 針灸機(jī)制研究與代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合的必要性

        代謝組學(xué)就是在生物體新陳代謝的動態(tài)進(jìn)程中,通過系統(tǒng)分析生物的體液、組織中的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物譜的變化,來研究生物體整體受到外部刺激后的生物狀況和調(diào)節(jié)功能。與基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)相比,它所關(guān)注的是生物體內(nèi)基因和蛋白的有效變化所產(chǎn)生的最終代謝物質(zhì)。代謝組學(xué)從最終代謝產(chǎn)物出發(fā),追溯生物體內(nèi)糖、蛋白質(zhì)、脂類物質(zhì)的代謝變化與疾病發(fā)生發(fā)展過程的關(guān)系,不僅可對疾病的衍變做到時-時追蹤,與基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)相比較,在對疾病相關(guān)性最強(qiáng)的信息(靶點(diǎn))篩選上較前兩種組學(xué)更為便捷。

        針灸治療作為一種外源性刺激,通過刺激生物體不同組織結(jié)構(gòu)(皮膚、肌肉、血管、神經(jīng)等)誘發(fā)信息傳導(dǎo)及生化調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的變化,作用具有多途徑、多層次、網(wǎng)絡(luò)化的整體特點(diǎn)。以往的針灸機(jī)制研究方法多采用單條或多條途徑、一個或多個靶點(diǎn)的研究方式進(jìn)行研究,但往往難以涵蓋全部針灸信號系統(tǒng),正如針灸基礎(chǔ)理論中,經(jīng)絡(luò)的內(nèi)涵不僅包括腧穴(刺激點(diǎn)),同時還包括“經(jīng)脈、絡(luò)脈、經(jīng)筋、皮部”等多個信號系統(tǒng)。因此,采用既往的微觀研究方法往往在獲得一組有效信息的同時會遺失針灸效應(yīng)中其他的重要信息。

        從代謝組學(xué)的特點(diǎn)來看,它研究的是外源性刺激情況下生物體系(細(xì)胞、組織或生物體)調(diào)整過程中,基因和蛋白的有效變化所產(chǎn)生的最終代謝物質(zhì)。能夠通過高通量的代謝物質(zhì)篩查對針灸的效應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行觀察,使研究者在同一時間段內(nèi)獲取盡可能多的生物信息,為針灸效應(yīng)的整體化研究提供新的契機(jī)。

        2 代謝組學(xué)技術(shù)與針灸機(jī)制研究結(jié)合研究現(xiàn)狀

        筆者通過文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn),近10年針灸代謝組學(xué)已有一定發(fā)展,并形成初步成果,但研究仍存在以下問題。

        2.1 研究病種 近10年吳巧鳳等[8]研究團(tuán)隊(duì)利用代謝組學(xué)技術(shù)開展了較為系統(tǒng)的針灸機(jī)制研究,對功能性消化不良患者進(jìn)行針刺治療并采用核磁共振(NMR)技術(shù)進(jìn)行代謝組學(xué)觀察[8-11],研究結(jié)果顯示,針刺組與服用依托必利比較,乳酸、葡萄糖和乙酰乙酸的含量提高,西藥組則主要表現(xiàn)為降低膽堿、亮氨酸/異亮氨酸的水平,說明針灸與藥物治療機(jī)理有所不同。其等還利用動物模型先后開展電針治療潰瘍性結(jié)腸炎、慢性情緒應(yīng)激焦慮研究,發(fā)現(xiàn)電針能夠調(diào)整潰瘍性結(jié)腸炎、焦慮模型大鼠的一般狀況,減輕潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸道黏膜炎性細(xì)胞浸潤,穩(wěn)定線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞結(jié)構(gòu)同時能夠調(diào)節(jié)大鼠血漿及大腦皮層代謝物含量[9-10]。但其研究病種集中于消化系統(tǒng)的功能性消化不良與潰瘍性結(jié)腸炎,未對針灸臨床常見疾病如胃炎、腸易激綜合征、便秘等進(jìn)行研究,對針灸治療同類疾病的機(jī)制橫向比對造成一定困難。

        另外,張景雪等[12]觀察隔藥灸臍針三陰交與針三陰交對原發(fā)性痛經(jīng)患者的血漿與尿液代謝產(chǎn)物影響,結(jié)果顯示隔藥灸臍針三陰交組可以直接通過提高一氧化氮、神經(jīng)降壓素,降低縮宮素、組胺的含量來緩解痛經(jīng)。Wen等[13]采用基于超高效液相色譜質(zhì)譜(UPLC擬MS)代謝組學(xué)技術(shù)分析急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠的尿液和血漿,研究結(jié)果顯示針刺可以改善急性痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎大鼠的血漿及尿液內(nèi)的代謝物水平。任超展等[14]采用不同針刺手法對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)家兔進(jìn)行治療并做代謝組學(xué)觀察,研究結(jié)果提示熱補(bǔ)針法治療RA使尿液代謝物譜向正?;貧w的調(diào)控優(yōu)于捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法、平補(bǔ)平瀉手法治療組。郭玲玲等[15]采用電針對SAMP8小鼠進(jìn)行治療,觀察血漿、肝腎組織代謝物變化,研究結(jié)果提示電針對血漿、肝、腎組織的代謝譜圖分別產(chǎn)生不同影響。以上研究病種分散,涉及到婦科、風(fēng)濕免疫、神經(jīng)系統(tǒng)多個方面,對針灸療法的特征信息提取造成困難。

        2.2 代謝組研究的標(biāo)本 隨著代謝組學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展,多種生物液體和組織均可用于代謝組學(xué)檢測。血漿和尿液樣本由于收集簡單、易于長期檢測和包含大量的代謝信息,已經(jīng)成為針灸代謝組學(xué)研究“整體模式”常用的標(biāo)本。如吳巧鳳等[11]檢測健康男性針刺前后血漿、尿液代謝物濃度,發(fā)現(xiàn)針刺足三里、梁門、巨髎等陽明經(jīng)穴可提升中糖類物質(zhì)的濃度和降低乳酸濃度,升高尿液中馬尿酸和氧化三甲胺的含量。陳勤等[16-17]檢測偏頭痛大鼠模型針灸治療前后血漿代謝物,發(fā)現(xiàn)少陽經(jīng)腧穴電針治療能夠降低偏頭痛大鼠血漿谷氨酸、乳酸水平。張景雪等[12]觀察隔藥灸臍針三陰交與針三陰交對原發(fā)性痛經(jīng)患者的血漿與尿液代謝產(chǎn)物影響。Wen等[13]采用基于超高效液相色譜質(zhì)譜(UPLC擬MS)代謝組學(xué)技術(shù)分析急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠的尿液和血漿代謝物水平。

        但應(yīng)注意,由于血漿或尿液只能代表生物體的平均代謝狀態(tài)或代謝組,不能獲得具體組織的代謝狀態(tài),因此代謝組學(xué)研究的組織應(yīng)注意局部與整體相結(jié)合。如吳巧鳳等[9]在電針治療潰瘍性結(jié)腸炎研究中,檢測大鼠血漿代謝物同時檢測大腦皮層代謝物含量。郭玲玲等[15]采用電針對SAMP8小鼠進(jìn)行治療,觀察血漿、肝腎組織代謝物變化,研究結(jié)果提示電針對血漿、肝、腎組織的代謝譜圖分別產(chǎn)生不同影響。

        從研究目的看,疾病的自然病程和針灸效應(yīng)二者演變是一個動態(tài)過程,采用尿液作為研究樣本的代謝組學(xué)研究可以在不干擾生物體的情況下完成對生物體內(nèi)物質(zhì)變化的客觀觀察,追蹤疾病和治療手段的時-效關(guān)系,但尿液作為代謝組學(xué)研究樣品,其代謝物含量受飲食、運(yùn)動及環(huán)境影響極大,存在不穩(wěn)定性,因此在代謝組學(xué)“時-效”研究中加入具有穩(wěn)定特征的代謝樣品(如關(guān)節(jié)液、腦脊液、組織器官等)的研究策略更具有科學(xué)性。

        2.3 研究類型 總結(jié)近10年針灸代謝組學(xué)文獻(xiàn),僅有2個針灸代謝組學(xué)研究觀察了來自于臨床的真實(shí)患者。進(jìn)一步分析臨床試驗(yàn)所占比較較低的原因,考慮目前代謝組學(xué)臨床研究的困難主要來源于以人為研究對象的代謝組學(xué)研究混雜因素過多,存在于生物樣品的內(nèi)在差異導(dǎo)致研究系統(tǒng)的穩(wěn)定性和可控性降低。但由于不同生物物種之間存在明顯差異,因此以動物實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)的研究結(jié)論需經(jīng)過多次重復(fù)驗(yàn)證才能夠直接運(yùn)用于臨床,不僅延長了研究時間,也消耗了大量的人力物力。因此,建立一種嚴(yán)謹(jǐn)且可行的針灸代謝組學(xué)臨床研究策略,是針灸療效機(jī)制研究與代謝組學(xué)技術(shù)的結(jié)合的關(guān)鍵步驟。

        3 討論

        盡管目前代謝組學(xué)檢測技術(shù)、數(shù)據(jù)分析方法及數(shù)據(jù)預(yù)處理軟件發(fā)展迅速,仍沒有任何一個研究系統(tǒng)能夠完全、準(zhǔn)確解釋和分析研究結(jié)果的變異性,進(jìn)一步影響了代謝組學(xué)研究結(jié)果的可靠性和客觀性,并增加了代謝組學(xué)研究的難度[18-19]。

        代謝組學(xué)研究結(jié)果的變異性主要來源于生物樣品的內(nèi)在差異和檢測方法的系統(tǒng)誤差。在代謝組學(xué)研究發(fā)展的前期,針對檢測方法、實(shí)驗(yàn)樣品預(yù)處理方法等研究較多,目前關(guān)于血清、血漿、尿液、關(guān)節(jié)液、唾液等常見組織液樣品的采集、滅活、儲存、處理和儀器分析過程的基本規(guī)范化技術(shù)參數(shù)已較為成熟,系統(tǒng)誤差已明顯降低。而存在于生物樣品的內(nèi)在差異處理和矯正仍是臨床研究的一大難題。21世紀(jì)以來,以正交信號校正(Orthogonal signal correction, OSC)為代表的,具有濾噪、提高模式識別功能的譜學(xué)信號校正技術(shù)和數(shù)據(jù)預(yù)處理軟件發(fā)展迅速。但不同的軟件對標(biāo)準(zhǔn)品和實(shí)際生物樣品圖譜峰對齊的準(zhǔn)確度仍存在差異,實(shí)際工作中需選擇多種不同軟件處理圖譜,并進(jìn)行交互驗(yàn)證,手工核對,降低了代謝組學(xué)研究的效率。因此,如何嚴(yán)格控制混雜因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾,建立規(guī)范、客觀和可信的實(shí)驗(yàn)研究規(guī)范是代謝組學(xué)應(yīng)用于臨床研究的重要保障,也是代謝組學(xué)結(jié)果作為臨床評價指標(biāo)的前提條件。

        筆者從事針灸臨床研究多年,曾有幸參與代謝組學(xué)研究工作,在研究過程中發(fā)現(xiàn)針灸臨床研究與藥物臨床研究具有明顯差異,因此其研究方法較藥學(xué)研究方法應(yīng)有所區(qū)別,現(xiàn)簡述如下,求正同道。

        從針灸刺激產(chǎn)生的代謝物質(zhì)信號看。針灸治療作為一種“外治”法,針灸效應(yīng)的產(chǎn)生,不同于藥物的干預(yù),其信號強(qiáng)弱取決于內(nèi)在的疾病和外來的腧穴刺激共同作用,故人體反應(yīng)能力的高低、疾病狀態(tài)對研究結(jié)果的影響較其他研究更為顯著。從前期代謝組學(xué)技術(shù)在針灸機(jī)制研究領(lǐng)域運(yùn)用情況看,針灸確實(shí)能夠引起人體血漿、尿液內(nèi)代謝產(chǎn)物表型改變,而其引起的代謝物質(zhì)的變化往往與生物信號傳遞、能量轉(zhuǎn)化等基礎(chǔ)生命過程相關(guān);與藥物實(shí)驗(yàn)相比,針灸刺激引起的代謝物質(zhì)變化可能缺乏固定的物質(zhì)特征與量-效關(guān)系,而與疾病信號關(guān)聯(lián)性更高,因此在數(shù)據(jù)分析時了解疾病的代謝特征尤為重要[10-14]。

        在代謝組學(xué)研究中,降低生物樣品自身攜帶的與研究目的無關(guān)的信號差異,無疑是降低生物樣品變異更好的方法。如在臨床研究中限定研究對象的來源,如住院或門診,疾病亞型與兼雜癥,受試者年齡、性別、人種、體重指數(shù)、飲食、活動量、晝夜節(jié)律及生理周期等。而在臨床實(shí)踐中,必須兼顧患者群體代表性與倫理學(xué)要求,不同受試者個體生活習(xí)慣上的差異往往難以避免。針對這一情況,目前代謝組學(xué)臨床研究多采用健康志愿者作為研究對象或?qū)φ?;或增加?shí)驗(yàn)樣本量,降低個體差異對于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。但筆者認(rèn)為,以健康志愿者作為對照,并不能完全模擬疾病的休止?fàn)顟B(tài),而來源于研究對象的生理變異,也應(yīng)在數(shù)據(jù)分析同時得到評估;目前代謝組學(xué)檢測費(fèi)用仍較為昂貴,僅靠實(shí)驗(yàn)樣本量的增大來消除無疑會增加實(shí)驗(yàn)成本,降低該研究方法的臨床可行性。

        針對以上問題,筆者提出以下建議:首先,在針灸代謝組學(xué)臨床研究方案中增加利于結(jié)果對比的臨床方法設(shè)計(jì)。如在穩(wěn)定性慢病中采用交叉實(shí)驗(yàn)或分層分析、配對分析,在發(fā)作性疾病研究中進(jìn)行重復(fù)測量、連續(xù)測量,降低受試者個體差異對結(jié)果的影響。其次,在臨床研究中增加濾噪和矯正處理。篩選可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的混雜因素,采用具有濾噪作用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案,如正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),同時觀察實(shí)驗(yàn)因素與非實(shí)驗(yàn)因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響;通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果分類,完成主、次要因素分析,進(jìn)一步進(jìn)行數(shù)據(jù)矯正分析,同時可減少不必要的樣本量消耗。再次,選擇合理的研究樣品。從實(shí)驗(yàn)樣品的篩選看,尿液、血液是最容易采集也是最易受飲食、運(yùn)動、晝夜節(jié)律等非實(shí)驗(yàn)因素影響的實(shí)驗(yàn)樣品,因此對于非住院患者、兼雜疾病較多的患者進(jìn)行尿液、血液代謝組學(xué)分析,結(jié)論應(yīng)謹(jǐn)慎。關(guān)節(jié)炎、組織液等實(shí)驗(yàn)樣品受非實(shí)驗(yàn)因素影響相對較低,在采集條件允許的情況下,可優(yōu)先考慮采用。必要時,可通過整合代謝組學(xué)(Integrated metabonomics)方法[20],對同一個體的多種生物樣品(尿液、血液、組織液等)進(jìn)行代謝組學(xué)數(shù)據(jù)比比對和綜合評價,提高代謝組學(xué)研究結(jié)果的完整性和準(zhǔn)確性。最后,治療性研究中,應(yīng)注重將組學(xué)研究數(shù)據(jù)與臨床療效評價數(shù)據(jù)相結(jié)合,以提高說服力和尋找代謝靶標(biāo)的成功率。

        代謝組學(xué)可以在不干擾(采取尿液、唾液等樣本)或有微量干擾(采取血液樣本)生物體的情況下完成對生物體內(nèi)物質(zhì)變化的客觀觀察,追蹤疾病和治療手段的時-效關(guān)系,反映生物的整體變化,在針灸的機(jī)制研究中具有良好的應(yīng)用前景。代謝組學(xué)技術(shù)與針灸療法結(jié)合的研究策略還有待進(jìn)一步探索。

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        (收稿日期:2015-12-25) (本文編輯:王宇)

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