王淑娟 劉文舉 王立克 等

摘要：從鵝腦組織中提取總RNA，利用RT-PCR擴(kuò)增Mel 1c基因cDNA序列。結(jié)果表明，Mel 1c基因序列長(zhǎng)為1 118 bp；與已報(bào)道其他物種的Mel 1c同源性為58.4%～72.2%；氨基酸序列的同源性為74.7%～97.0%；該基因編碼的蛋白質(zhì)為N端在胞內(nèi)的六次跨膜蛋白，含有信號(hào)肽的分泌蛋白，N端亦含有兩個(gè)糖基化位點(diǎn)；該蛋白也含有G蛋白偶聯(lián)受體家族的結(jié)構(gòu)域。

關(guān)鍵詞：鵝；Mel 1c基因；克??；生物信息學(xué)

中圖分類(lèi)號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）04-1028-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.04.053

Cloning of Mel 1c Gene in Goose and Analysis of Bioinformatics

WANG Shu-juan，LIU Wen-ju，WANG Li-ke，PANG Xun-sheng，CHE Chuan-yan

（Colloge of Animal Science，Anhui Science and Technology University， Fengyang 233100， Anhui，China）

Abstract：The total RNA was extracted from the brain of goose and method followed by RT-PCR amplification of the Mel 1c gene. The cloned Mel 1c gene sequence length was 1 118 bp. Comparing to the Mel 1c genes published， the cloned nucleotide fragments showed the highest sequence identity between 58.4% and 72.2%，meanwhile its putative amino acid sequence homology varies from 74.7%～97.0%. The protein may be a cytoplasmic N-termini and six-transmembrane domains. While it may be a signal peptides of the secreted proteins and has two N-linked glycosylated sites. The protein belongs to a superfamily of G-protein coupled receptors.

Key words： goose； Mel 1c gene； clone； bioinformatics

褪黑素（Melatonin，Mel）是由松果體分泌的一種吲哚類(lèi)激素，其化學(xué)名稱(chēng)為N-乙酰-5-甲氧基色胺（N-acetyl-5-methoxytryptomine）[1]。Mel是一種具有多種功能的光信號(hào)，通過(guò)其分泌水平的改變，將環(huán)境光照周期信息傳遞給體內(nèi)有關(guān)組織和器官，使其功能活動(dòng)適應(yīng)外界的變化。1958年，美國(guó)皮膚病專(zhuān)家Lerner等首次從牛的松果體中分離出了褪黑素。此后，褪黑素作為松果體分泌的生物活性最強(qiáng)的物質(zhì)，其重要性逐漸得到認(rèn)識(shí)，研究也越來(lái)越深入。松果體合成釋放Mel具有明顯的節(jié)律性，白晝下呈靜止?fàn)顟B(tài)，夜晚來(lái)臨合成增加，人類(lèi)在夜晚03：00～04：00分泌達(dá)到高峰[2]。褪黑素及其受體廣泛存在于大腦、下丘腦、中腦、嗅球、視交叉上核等腦區(qū)及脊髓和視網(wǎng)膜。近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)在心、肝、脾、肺、腎、胃腸、胸腺、淋巴結(jié)、腎上腺、性腺等均存在[3]。褪黑素受體分為Mel 1a、Mel 1b 和Mel 1c等3種亞型[4]。Mel 1a多分布于下丘腦視交叉上核及垂體結(jié)節(jié)部，其N(xiāo)端含有2個(gè)糖基化位點(diǎn)，各種來(lái)源的Mel 1a之間氨基酸同源性高達(dá)80%以上。Mel 1b基因多在視網(wǎng)膜中表達(dá)，其N(xiāo)端含有一個(gè)糖基化位點(diǎn)，與Mel 1a之間氨基酸同源性約為60%。與前2種受體相比，Mel 1c C端多了66個(gè)氨基酸殘基，氨基酸的同源性也在60%左右，跨膜區(qū)的同源性可達(dá)到77%。而具有明顯季節(jié)性繁殖特征的動(dòng)物僅在垂體結(jié)節(jié)部發(fā)現(xiàn)Mel 1a，表明垂體結(jié)節(jié)部可能是褪黑激素繁殖效應(yīng)的作用位點(diǎn)[5]。研究表明，Mel 1b基因的表達(dá)沒(méi)有節(jié)律性，而Mel 1a和Mel 1c都有節(jié)律性表達(dá)，兩者有很多相似性，如Mel 1c對(duì)光的反應(yīng)和Mel 1a一致，即隨著晝夜節(jié)律的變化，受體mRNA隨之變化，高峰出現(xiàn)在夜晚[6]。目前，對(duì)褪黑素的研究主要集中在Mel 1a基因?qū)?dòng)物的生殖作用，Mel 1c與Mel 1a基因存在很多相似和不同，所以對(duì)Mel 1c基因的研究更有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)對(duì)象 成年母鵝1只，取新鮮腦組織于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 RNA提取Trizol試劑（購(gòu)自Invitrogen公司）、M-MLV RT反轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA 聚合酶等（購(gòu)自Fermentas公司）、dNTP Mix[購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司]、DNA回收試劑盒[購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司]、pMD18-T載體（購(gòu)自武漢亞法生物技術(shù)公司）。

1.2 方法

1.2.1 腦組織總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 取腦組織約0.1 g，采用Trizol法提取總RNA，溶于40 μL DEPC水中，-80 ℃保存?zhèn)溆?。反轉(zhuǎn)錄：5 μL總RNA、 0.5 μL Oligo（dT）15 Primer（0.5 μg/μL），70 ℃ 5 min，迅速預(yù)冷2 min；然后加入11.75 μL DEPC-H2O、5 μL M-MLV RT 5×Buffer、1.25 μL dNTPs、0.5 μL RNasin Ribonuclease Inhibitor（40 U/μL）和1 μL M-MLV Reverse Transcriptase（200 U/μL），42 ℃ 60 min，72 ℃ 10 min，得到cDNA，置于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 Mel 1c基因的克隆 根據(jù)GenBank中雞和其他動(dòng)物的Mel 1c基因序列，針對(duì)序列保守區(qū)域利用Primer5.0軟件優(yōu)化設(shè)計(jì)2對(duì)引物，引物1上游：5′-GGTGCTGAGGAACAAGAAG-3′、引物1下游： 5′-TGCTTTTCAGCCCTTCTG TC-3′；引物2上游： 5′-TTTTAACAGCTGCCTCAATG-3′，引物2下游：5′-AAGGTAAAGGGCAGTTGTTC-3′，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物1上游引物靠近5′端，引物2下游引物靠近3′端，然后對(duì)兩對(duì)引物擴(kuò)增的序列進(jìn)行拼接即為克隆到的Mel 1c基因部分序列。

以合成的cDNA第一鏈為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：10×Buffer 2.5 μL、dNTPs 0.5 μL、上游引物（10 μmol/L）0.8 μL、下游引物（10 μmol/L）0.8 μL、2 μL cDNA、0.5 μL Taq酶（5 U/μL），加ddH2O補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，68/51.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠回收試劑盒回收。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定 目的片段與pMD18-T載體按照10 μL體系：0.3 μL pMD18-T vector、2.5 μL Solution Ⅰ、7.2 μL回收產(chǎn)物DNA，混合均勻后4 ℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，用Amp+平板37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取單菌落小量培養(yǎng)，然后PCR鑒定重組質(zhì)粒，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.2.4 分子進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建 將不同物種的氨基酸序列包括測(cè)得的鵝序列使用EBI 中的Tools軟件ClustalW程序構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)，對(duì)獲得的cDNA序列進(jìn)行Blast同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Mel 1c基因的克隆鑒定

對(duì)挑取的單菌落進(jìn)行PCR鑒定，引物1擴(kuò)增的條帶大小為850 bp，引物2擴(kuò)增的條帶為415 bp，片段大小與預(yù)期的相一致如圖1，引物1和引物2擴(kuò)增的產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明為Mel 1c基因。

2.2 Mel 1c基因核苷酸及其氨基酸序列分析結(jié)果

RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果片段分別為850 bp和415 bp，對(duì)兩段序列進(jìn)行拼接，得到大小為1 118 bp的片段。Blast比對(duì)結(jié)果表明，該序列含有Mel 1c基因編碼區(qū)和非編碼區(qū)。該編碼區(qū)與已報(bào)道動(dòng)物的Mel 1c具有較高的同源性。由ExPASy的ProtParamToo軟件分析該片段共編碼299個(gè)氨基酸（圖2），分子質(zhì)量為33 872.4，pI為9.51，且為疏水性蛋白質(zhì)。Mel 1c蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示（圖3），α螺旋占很大比例，其次為無(wú)規(guī)則卷曲、折疊和β轉(zhuǎn)角。此外，預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)為分泌蛋白，包含一個(gè)信號(hào)肽，其剪切位點(diǎn)位于26和27之間（VVA-VY）（圖4-1）；與Mel 1a相同的是其N(xiāo)端亦含有兩個(gè)糖基化位點(diǎn)；而且該蛋白具有G蛋白偶聯(lián)受體家族1的結(jié)構(gòu)域（1-244），含6個(gè)強(qiáng)的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)（圖4-2）；經(jīng)亞細(xì)胞定位分析預(yù)測(cè)其可能位于漿膜、高爾基體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。鵝Mel 1c基因部分cDNA序列和氨基酸序列分別與其他已知物種Mel 1c基因cDNA序列與氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)（圖5、圖6）。結(jié)果表明，鵝與鮒魚(yú)、斑馬魚(yú)、蟾魚(yú)、點(diǎn)籃子魚(yú)、香魚(yú)、鳴禽歐椋鳥(niǎo)、原雞、狼鱸和點(diǎn)帶石斑魚(yú)的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分別在58.4%～72.2%和74.7%～97.0%之間，和香魚(yú)的核苷酸序列同源性達(dá)到72.2%，而與原雞的氨基酸序列同源性達(dá)到97.0%。

2.3 分子進(jìn)化樹(shù)

Mel 1c基因中度保守，不同物種間有相同的結(jié)構(gòu)域。分子進(jìn)化樹(shù)（圖7）表明，Mel 1c基因符合進(jìn)化規(guī)律，斑馬魚(yú)是最低等的脊椎動(dòng)物，而鵝處于分子進(jìn)化樹(shù)的最頂層。

3 小結(jié)與討論

研究表明，Mel 1a和Mel 1b基因存在于所有脊椎動(dòng)物，而Mel 1c基因僅在非哺乳類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)存在（如鳥(niǎo)類(lèi)、禽類(lèi)、魚(yú)類(lèi)等）[7]。對(duì)哺乳動(dòng)物體內(nèi)環(huán)境的調(diào)節(jié)起作用的是Mel 1a；脊椎動(dòng)物中存在的褪黑素受體Mel 1c與Mel 1a是否有相同的作用還未見(jiàn)報(bào)道。本研究克隆了鵝Mel 1c基因的部分cDNA序列，為分離克隆鵝Mel 1c全序列提供了可能。通過(guò)Blast分析，發(fā)現(xiàn)該擴(kuò)增序列與雞的相應(yīng)區(qū)域的氨基酸的同源性為97.0%，并且與其他物種的該基因也有較高的同源性，這說(shuō)明相似物種同一基因在進(jìn)化過(guò)程中更加保守。Mel 1c蛋白可能為具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)域和功能蛋白的膜蛋白，且Mel 1c為6個(gè)跨膜蛋白，而跨膜結(jié)構(gòu)多構(gòu)成受體、通道，執(zhí)行信號(hào)傳導(dǎo)等重要功能[8，9]。Mel 1c受體蛋白為G偶聯(lián)受體家族1，提示其可能具有G偶聯(lián)受體家簇1的基本生物學(xué)功能，如Mel 1a通過(guò)調(diào)節(jié)cAMP在組織細(xì)胞中的濃度來(lái)調(diào)節(jié)動(dòng)物體的生殖生理作用。

研究表明，褪黑素不僅通過(guò)垂體-下丘腦-性腺軸對(duì)動(dòng)物的生殖性能有重要的調(diào)節(jié)作用，而且也可以直接作用于卵巢。Michelle等[10]研究發(fā)現(xiàn)褪黑素對(duì)人體黃體化顆粒細(xì)胞中的GnRHR、LHR有調(diào)節(jié)作用，結(jié)果表明，GnRH和GnRHR的mRNA水平明顯降低，而LHR mRNA水平增加。在禽類(lèi)中Mel 1c結(jié)合褪黑素是否直接作用于卵巢有待進(jìn)一步研究，克隆Mel 1c基因的功能結(jié)構(gòu)區(qū)，并分析其編碼產(chǎn)物的基本特性，為深入功能和分子機(jī)制研究以及在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，而且為進(jìn)一步完善褪黑素作用體系有重要的作用。

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