張瀟丹 徐溢 張濤 呂君江

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摘 要 設(shè)計并制作了一種集成有8個重復(fù)6×6細(xì)胞培養(yǎng)單元的陣列微流控細(xì)胞芯片，以實現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)和系列植物組分的細(xì)胞抗氧化活性（Cellular antioxidant activity，CAA）分析。芯片主要包含聚二甲基硅烷蓋片、288個圓形培養(yǎng)腔體，48個獨立平行通道的玻璃基底層，一次可完成8個樣本的6個濃度篩選，并可在酶標(biāo)儀上實現(xiàn)測試。槲皮素、蘆丁和山奈酚等植物組分與芯片上培養(yǎng)的細(xì)胞作用24 h，細(xì)胞存活率大于90%。以芯片上培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞HepG2為細(xì)胞載體，以2′，7′二氯熒光素乙酰乙酸酯（2′，7′Dichlorofluorescin diacetate， DCFHDA）為熒光探針，采用2，2′偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（2，2′azobis（2amidinopropane） dihydrochloride，ABAP）為細(xì)胞內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）引發(fā)劑，測得槲皮素、蘆丁、山奈酚等植物組分的CAA unit分別為71.42±0.19、74.31±0.36和69.92±0.09（±s， n=3），IC50分別為（7.20±0.06） μmol/L， （52.06±0.14） μmol/L， （32.55±0.03） μmol/L（±s， n=3）。

關(guān)鍵詞 陣列微流控細(xì)胞芯片； 細(xì)胞抗氧化活性； 高通量； 篩選

1 引 言

近年來，藥物細(xì)胞毒性和藥效評價已成為新藥研發(fā)中化合物篩選的主要觀測指標(biāo)。在抗氧化活性評價研究中，Wolfe[1]建立了細(xì)胞抗氧化活性（Cellular antioxidant activity，CAA）分析方法，在細(xì)胞水平上測定抗氧化劑對自由基氧化的抑制效果，并對水果和蔬菜中活性物質(zhì)進行抗氧化活性測定。隨后，Karl[2]和Zhao[3]等借鑒該法進行了植物提取物CAA分析。然而，這些方法依舊面臨著通量低、測試過程復(fù)雜等問題。因此，如何更好地將CAA測試方法與高通量、高內(nèi)涵分析技術(shù)結(jié)合，實現(xiàn)快速準(zhǔn)確、高自動化的篩選，仍是亟需解決的問題。為此，研究人員開發(fā)了多種新型技術(shù)，以便在藥物研發(fā)過程中盡早確定化合物的安全特性和功效。其中微流控芯片分析技術(shù)較以往的篩選技術(shù)更具有優(yōu)勢，可將樣品預(yù)處理、反應(yīng)、衍生、分離和檢測等分析步驟微型化到一個芯片上，以流體和陣列多通道的形式縮短分析時間，在低耗樣量的狀態(tài)下提供一個進行細(xì)胞生理、生化分析的微環(huán)境，具有快速分析、信息量大、制作成本低等優(yōu)點[4]，因而成為極具潛力的藥效測試新平臺。如，F(xiàn)rey等[5]設(shè)計的可重組式微液滴器官芯片、Espulgar等[6]設(shè)計的離心式細(xì)胞芯片。Ye等[7]設(shè)計了結(jié)構(gòu)非常緊密的由8個對稱的藥物濃度梯度發(fā)生器和細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)組成的微流控芯片，一次可完成8個樣本的8個濃度篩選，利用該芯片培養(yǎng)肝微粒體，通過與下游的芯片電泳和細(xì)胞培養(yǎng)單元集成，可同時完成藥物代謝物檢測和毒性評價。Xu等[8]基于濃度梯度發(fā)生器和三維細(xì)胞培養(yǎng)單元建立的藥敏測試平臺中的芯片設(shè)計更為簡單巧妙，濃度梯度的產(chǎn)生依賴于3組不同長度的微通道（5.7/7.5/12.5 mm）和不同直徑的彎曲通道（0.2/0.23/0.3 mm），利用該芯片一次完成了4個樣本3個濃度的測試，可方便地用于肺癌的個體化治療。因此，將微流控芯片技術(shù)用于細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性測試研究，對于抗氧化活性藥物的高通量高內(nèi)涵測試和篩選同樣具有啟發(fā)性。

本研究設(shè)計并制作了一種集成了8個重復(fù)6×6陣列細(xì)胞培養(yǎng)單元的陣列微流控細(xì)胞芯片，實現(xiàn)了芯片上細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)和化合物對細(xì)胞毒性檢測，將其與CAA測試方法結(jié)合，搭建了一個細(xì)胞抗氧化活性芯片分析平臺，并采用植物抗氧化劑槲皮素、蘆丁和山奈酚進行芯片功能測試。結(jié)果表明，此芯片可以很好地發(fā)揮體外活性評價作用。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

HH.CP7W二氧化碳培養(yǎng)箱（上海博迅公司）；ZDX35BI電熱壓力蒸汽滅菌器（上海申安公司）；IX71奧林巴斯熒光顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）；SynergyTM HT多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）。SWCJ1FD超凈臺（蘇州凈化公司）；流動注射泵（美國Harward公司）。

含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（美國HyClone公司）。二甲基亞砜、多聚賴氨酸（分子量30000～70000）、2，2′偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽、二氯二氫熒光素乙酰乙酸酯、羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（美國Sigma公司）。山奈酚、蘆丁和槲皮素（純度>98%）。人肝癌細(xì)胞HepG2懸浮液，濃度為106 個/mL，生存狀態(tài)為對數(shù)生長期，取自重慶市西南醫(yī)院消化科。

2.2 實驗方法

2.2.1 陣列微流控細(xì)胞芯片的制作及檢測系統(tǒng) 如圖1A和圖2所示，設(shè)計了基于6×6細(xì)胞培養(yǎng)單元的陣列微流控細(xì)胞芯片及其檢測系統(tǒng)。采用標(biāo)準(zhǔn)光刻濕刻方法將掩膜圖形轉(zhuǎn)移至玻璃板，經(jīng)過曝光、顯影、濕法刻蝕和去膠等步驟（圖1B），最終制成了一個含有288個圓形培養(yǎng)腔體、48個獨立平行通道的芯片玻璃層。實驗前將聚二甲基硅烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）預(yù)聚體與固化劑混合均勻，脫氣后澆鑄于載玻片上，放置在烘箱中80℃條件下加熱固化1 h形成PDMS蓋片。與芯片玻璃層可逆鍵合成PDMS玻璃復(fù)合芯片。在檢測時，將芯片固定在孔板讀數(shù)儀的托架上，儀器參數(shù)設(shè)置選擇96孔板板型，并通過Plate layout設(shè)置相應(yīng)檢測孔。

2.2.2 陣列微流控細(xì)胞芯片上肝癌細(xì)胞HepG2的培養(yǎng) 將芯片清洗干凈，滅菌處理。通過流動注射泵，從芯片中心口M到兩端口E連續(xù)泵入10 μg/mL的多聚賴氨酸（PolyLLysine，PLL）溶液5～10 min，泵出多余液體，將芯片放置于超凈臺內(nèi)晾干，使PLL充分包被微流控陣列芯片的微腔和管道。接種細(xì)胞前，由芯片中心口M到兩端口E連續(xù)泵入無水乙醇以排除氣泡，PBS清洗和培養(yǎng)基浸潤管道。隨后取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞由芯片兩端口E到中心口M接種于芯片上，在37℃于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h， 更換新鮮培養(yǎng)基。此后每隔6～7 h為芯片上所培養(yǎng)的細(xì)胞換液。

2.2.3 陣列微流控細(xì)胞芯片上植物抗氧化劑與細(xì)胞相互作用測試 芯片上培養(yǎng)細(xì)胞24 h。利用自行搭建的微分析系統(tǒng)，測試植物抗氧化劑對芯片上HepG2細(xì)胞生長的影響。將系列含不同濃度植物抗氧化劑的培養(yǎng)基，從芯片兩端口E輸入，保持液體在兩端口與中心口液面的高度差，液體緩緩地流過陣列微流控細(xì)胞芯片的PDMS玻璃通道和微腔，匯集到芯片中心口M，由M引出多余液體。芯片于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在系列植物抗氧化劑作用下細(xì)胞繼續(xù)生長24 h。由M到E用PBS沖洗細(xì)胞2 min，通入50 μmol/L 羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）孵育細(xì)胞3 min。選擇488 nm激發(fā)波長和518 nm觀測波長， 孔板讀數(shù)儀上讀數(shù)。測試中需手動調(diào)節(jié)芯片位置1次。實驗測得各細(xì)胞腔體內(nèi)不同樣本濃度作用下CFSE標(biāo)記細(xì)胞熒光強度，按照公式（1）計算細(xì)胞活力（Cell viabitity， CV）：

CV（%）=Fludose/Flucontrol×100% （1）

式中：Fludose表示單次實驗中化合物作用下微腔平均熒光強度，F(xiàn)lucontrol表示單次實驗中對照腔體平均熒光強度。

2.2.4 陣列微流控細(xì)胞芯片上植物抗氧化劑的CAA測試

芯片上培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，除去培養(yǎng)液，PBS清洗2 min，同2.2.2節(jié)操作，芯片兩端口E通入系列含不同濃度植物抗氧化劑和25 μmol/L DCFHDA的細(xì)胞培養(yǎng)基，將芯片靜置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中30 min，無菌PBS由M到E小心沖洗5 min。用200 μmol/L ABAP溶液處理，在孔板讀數(shù)儀上，同2.2.3節(jié)操作，選擇488 nm激發(fā)波長和525 nm觀測波長測定作用0～90 min的熒光值。同時，在90 min時，熒光倒置顯微鏡下逐個觀察各腔體內(nèi)HepG2細(xì)胞的熒光圖譜。

實驗測得HepG2細(xì)胞平均相對熒光強度時間曲線，用Origin8.5軟件計算積分面積，按照公式（2）計算CAA值。通過CAA值濃度關(guān)系反映細(xì)胞熒光物質(zhì)的減少量，從而反映該化合物的抗氧化能力。

3 結(jié)果與討論

3.1 陣列微流控細(xì)胞芯片的設(shè)計制作及表征

如圖1A，設(shè)計的陣列微流控細(xì)胞芯片的每個芯片單元有6條平行的陣列管道，每條管道有6個直徑為500 μm的圓形細(xì)胞培養(yǎng)腔，可同時進行6組不同的實驗，每組有6個平行實驗值，有效提高了結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。圓形腔體設(shè)計能有效減緩流速，降低剪切力對細(xì)胞的影響，有利于細(xì)胞停留。每條管道相距5 mm，相鄰培養(yǎng)腔中心連線相距1 mm，與酶標(biāo)儀相匹配。芯片中心口M和兩端口E分別設(shè)有儲液池。實體單元芯片的尺寸如圖1A，深度為50 μm，尺寸符合設(shè)計要求。基于高通量藥物測試的需求，將8個這樣的芯片單元集成在一塊96孔板尺寸大小的玻璃上，集成芯片上有288個培養(yǎng)腔，48個獨立通道，可完成8種不同樣本的6個濃度篩選。

3.2 陣列微流控細(xì)胞芯片上肝癌細(xì)胞HepG2的培養(yǎng)

PLL能形成一層帶正電荷的親水性表面，從而促使表面含有大量陰性糖蛋白的細(xì)胞更易吸附在培養(yǎng)腔內(nèi)。實驗發(fā)現(xiàn)通過PLL處理微管道和培養(yǎng)腔后，細(xì)胞貼壁時間可縮至4 h，且在腔體內(nèi)分布均勻，與細(xì)胞培養(yǎng)瓶等常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)載體相比，細(xì)胞的形態(tài)和生長增值無顯著差異。培養(yǎng)24 h后細(xì)胞生長狀態(tài)良好（圖3）。此芯片可實現(xiàn)連續(xù)72 h的細(xì)胞培養(yǎng)。

3.3 陣列微流控細(xì)胞芯片上植物抗氧化劑與細(xì)胞相互作用結(jié)果

實驗中每個樣本由圖2A所示的1個6×6芯片單元完成其與細(xì)胞相互作用的測試，設(shè)5個樣本濃度，1個空白對照，每個濃度6個平行。用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對濃度為0～300 μmol/L的槲皮素、蘆丁和山奈酚對細(xì)胞生長影響進行統(tǒng)計分析，p>0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義，表明在以上濃度范圍內(nèi)植物氧化劑對HepG2細(xì)胞生長基本無影響（表1）。槲皮素、蘆丁和山奈酚作用于HepG2細(xì)胞24 h后，與對照組腔體中一樣，培養(yǎng)腔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量多，排列緊密，生長狀態(tài)良好，CFSE標(biāo)記細(xì)胞發(fā)出均勻一致的綠色熒光（圖4）。

3.4 陣列微流控細(xì)胞芯片上系列植物抗氧化劑的CAA測試結(jié)果

實驗中每個樣本采用圖2A所示的1個芯片單元，設(shè)5個樣本濃度，1個空白對照，每個濃度6個平行腔體。酶標(biāo)儀上測得槲皮素、蘆丁和山奈酚作用下的DCFHDA標(biāo)記HepG2細(xì)胞熒光強度時間曲線（圖5），其熒光強度隨陣列微流控細(xì)胞芯片不同管道內(nèi)通過的抗氧化劑摩爾濃度增加而有不同程度的下降。在芯片熒光測試過程中，用熒光倒置顯微鏡觀察不同濃度的槲皮素、蘆丁和山奈酚作用下細(xì)胞內(nèi)熒光強度的變化，可更加直觀地看出其抗氧化效果。

CAA法測定抗氧化劑作用下陣列微流控細(xì)胞芯片上所培養(yǎng)HepG2細(xì)胞中產(chǎn)生的ROS導(dǎo)致DCF形成的能力。與對照組相比，細(xì)胞熒光物質(zhì)的減少量就能反映該化合物的抗氧化能力。實驗中的DCFHDA本身沒有熒光，它可以自由穿過細(xì)胞膜，進入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成無熒光的DCFH。而DCFH不能通透細(xì)胞膜，從而使DCFHDA熒光探針很容易地被裝載到細(xì)胞內(nèi)。同時，進入細(xì)胞內(nèi)的ABAP裂解成ROS，可以氧化DCFH生成有熒光的DCF，檢測DCF的熒光強度就可以反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。由于HepG2細(xì)胞熒光強度與細(xì)胞內(nèi)ROS水平呈正比，熒光強度越高，ROS含量越高，因此與對照組相比，化合物降低細(xì)胞熒光強度能力可以反映其能夠降低細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，即此化合物的抗氧化能力。

槲皮素、蘆丁和山奈酚具有明顯的抗氧化活性，并且存在一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，即抗氧化作用隨其摩爾濃度的增加而增強（p<0.05）。如圖5所示，隨著濃度增大，不同植物抗氧化劑作用下腔體內(nèi)細(xì)胞熒光強度越來越弱?？梢郧宄目吹?，槲皮素的活性氧清除效率要優(yōu)于蘆丁，但是最終能夠清除的活性氧量，蘆丁要優(yōu)于槲皮素。CAA值達到50時，3種化合物的摩爾濃度IC50如表1所示。

由表1可知，在作用于HepG2時，槲皮素、蘆丁和山奈酚的CAA值：蘆丁>槲皮素>山奈酚，IC50：蘆丁>山奈酚>槲皮素，即這3種植物抗氧化劑細(xì)胞內(nèi)自由基清除能力：蘆丁>槲皮素>山奈酚，而自由基清除效率：槲皮素>山奈酚>蘆丁，數(shù)據(jù)趨勢與文獻中96孔板測試一致[2，10]。研究表明，黃酮類化合物具有很強的抗氧化性，在水溶液體系中雙糖苷優(yōu)于苷元。此外，清除自由基活性與羥基數(shù)目相關(guān)，一般酚羥基越多，抗氧化性越好。而在生物模型中，由于細(xì)胞膜是脂溶性的，脂溶性藥物更易進入細(xì)胞，抗氧化活性苷元優(yōu)于雙糖苷。如表1和圖5所示，高濃度下，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中有充足的抗氧化劑時，抗氧化能力表現(xiàn)出與水溶液中實驗結(jié)果相似的特性，表現(xiàn)為雙糖苷（蘆丁）優(yōu)于黃酮苷元（槲皮素），優(yōu)于類黃酮（山奈酚）。而在低濃度下，化合物抗氧化能力取決于進細(xì)胞難易，因此，黃酮苷元（槲皮素）優(yōu)于類黃酮（山奈酚），優(yōu)于雙糖苷（蘆丁）。因此，利用此實驗芯片不僅可以實現(xiàn)細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)，通過靈活組合單元芯片，還可以實現(xiàn)多種植物氧化劑與細(xì)胞相互作用分析和抗氧化活性的評價，與已有結(jié)果符合。芯片設(shè)計不僅充分體現(xiàn)了CAA方法在抗氧化活性評價中的優(yōu)越性，而且與酶標(biāo)儀匹配，檢測方便快捷。

4 結(jié) 論

本研究設(shè)計并制作了基于6×6細(xì)胞培養(yǎng)單元的陣列微流控細(xì)胞芯片，芯片結(jié)構(gòu)簡單，操作方便，實驗中可據(jù)不同測試需要對各單元和進出口進行靈活組合。實驗中，將芯片與CAA測試方法相結(jié)合，利用實驗室自行搭建的微流控分析平臺，定量評價了植物抗氧化劑（槲皮素、蘆丁和山奈酚）的活性氧清除效率和活性氧清除能力，表現(xiàn)為其IC50分別為（7.20±0.06） μmol/L、 （52.06±0.14） μmol/L和（32.55±0.03） μmol/L，CAA值分別為71.42±0.19、74.31±0.36和69.92±0.09。此陣列微流控細(xì)胞芯片上可同時完成8種不同樣本的多濃度測試，為高通量測試奠定基礎(chǔ)。實驗表明，此微系統(tǒng)和測試方法樣本適應(yīng)性強，不僅具有很好的區(qū)分各種抗氧化劑的抗氧化效果，包括自由基清除效率和能力，定量評價抗氧化劑的抗氧化活性，還可以用于藥物對腫瘤細(xì)胞殺傷作用的研究，為現(xiàn)代藥物篩選和研究中的高內(nèi)涵測試提供參考。

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Assessing Plant Antioxidants by Cellular Antioxidant Activity Assay

Based on Microfluidic Cell Chip with Arrayed Microchannels

ZHANG XiaoDan1，2，3， XU Yi1，2，3， ZHANG Tao1，2，3， L

JunJiang1

1（College of Chemistry and Chemical Engineering， Chongqing University， Chongqing 400030， China）

2（Key Disciplines Lab of Novel Micronano Devices and System Technology， Chongqing 400030， China）

3（International R & D center of Micronano Systems and New Materials Technology， Chongqing 400030， China）

Abstract An integrated microfluidic chip with arrayed micro channels that consisted of eight repeat arrayed 6×6 cell culture chamber was designed and fabricated. The analytical microsystem combined with designed microchip， measuring device and environmental control unit was established for cell culture and parallel cellular antioxidant activity （CAA） analysis of plant antioxidants. The microfluidic chip included a polydimethylsiloxane （PDMS） cover and glass substrate that consisted of two hundreds and eightyeight round cell culture microchambers and fortyeight independent parallel array channels. Eight groups of different samples with six different concentrations could be investigated simultaneously with multimode reader in one test. HepG2 cells were successfully cultured on the microchip. Moreover， the viability percentage of the HepG2 cells exposed to these plant antioxidants solutions at different concentrations for 24 h was higher than 90%. With 2′，7′Dichlorofluorescin diacetate （DCFHDA） as a fluorescence probe， 2，2′azobis（2amidinopropane） dihydrochloride （ABAP） as the initiator of intracellular reactive oxygen species （ROS）， we tested the inhibitory effect of several plant antioxidants such as quercetin， rutin and kaempferol on free radicals. The CAA units were calculated by the data measured from cellular morphology and fluorescence intensity over time. It was shown that the CAA units of quercetin， rutin and kaempferol were 71.42±0.19， 74.31±0.36 and 69.92±0.09 （±s， n=3）， while the calculated IC50 were （7.20±0.06） μmol/L， （52.06±0.14） μmol/L and （32.55±0.03） μmol/L （±s， n=3）， respectively.

Keywords Microfluidic cell chip with arrayed microchannels； Cellular antioxidant activity； High throughput； Screening

（Received 27 July 2015； accepted 4 October 2015）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 21375156）， National Mightech R&D Program （863 program）（No.2015AA021104） and the Fundamental Research Fund for the Central Universities （No. 106112015CDJZR225512）