黃艷艷　高丹丹　許傳田　楊少華　黃慶華　張琳　張秀美　吳家強

摘要：為建立檢測雞干擾素誘生的3種抗病毒蛋白（IFIT5、PKR和OASL）基因表達水平的熒光定量PCR方法，并將其應用于實踐，本研究設(shè)計和篩選了3個基因的特異性擴增引物，制備了各基因的質(zhì)粒標準品，繪制了熒光定量PCR的標準曲線，并檢測了該方法的靈敏度、重復性和特異性。結(jié)果表明所建立的方法敏感度高、特異性強、檢測線性范圍廣、重復性好，應用該方法檢測了新城疫病毒感染SPF雞胚后相關(guān)基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)在病毒感染后IFIT5、PKR與OASL基因的表達水平均迅速提高。

關(guān)鍵詞：雞；抗病毒蛋白；檢測；熒光定量PCR

中圖分類號：S851.34⁺7.201 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2016）04-0119-05

當病毒感染動物機體時，病毒以其攜帶的病原相關(guān)分子模式（pathogen-related molecular pat-tem，PAMP）識別機體細胞的模式識別受體（pat-tem-recognition receptor，PRR），進而激活相應的配體，啟動機體固有免疫通路的轉(zhuǎn)導，誘導產(chǎn)生干擾素（Interferon，IFN）和促炎性細胞因子。干擾素并不直接作用于病毒，而是通過激活干擾素刺激基因（IFN stimulated genes，ISGs）的轉(zhuǎn)錄和表達，產(chǎn)生多種抗病毒蛋白（Antiviral protein，AVP）而發(fā)揮機體的抗病毒效應。目前發(fā)現(xiàn)的ISGs已超過300種。在ISGs表達產(chǎn)生的為數(shù)眾多的抗病毒蛋白中，雙鏈RNA依賴的蛋白激酶（Double-stranded RNA-dependent protein ki-nase，PKR）、2，5腺苷酸合成酶（2，5-Oligoadenylate synthetase，OAS）和IFIT（In-terferon induced proteins with tetratricopeptide re-peats）家族分子在機體抵抗多種病毒感染中發(fā)揮著十分重要的作用。

建立靈敏、快速的抗病毒蛋白定量檢測方法，對于深入了解病毒的致病機制、研究開發(fā)新型疫苗和抗病毒藥物均具有非常重要的意義。熒光定量PCR（Q-PCR）技術(shù)是目前對基因表達進行定量檢測的金標準，被廣泛應用于各種樣品中基因mRNA水平的檢測。其中SYBR Green I熒光染料法以其使用方便、成本低廉等優(yōu)點而被廣泛使用。本研究旨在建立檢測雞PKR、OASL和IFIT5基因轉(zhuǎn)錄水平的實時熒光定量PCR方法，并將其用于檢測病毒感染后相應基因的表達變化，以驗證所建立方法的實際應用效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新城疫病毒（NDV）弱毒疫苗株LaSota、NDV分離株Duck/China/SD03/2009，由山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室保存；9～11日齡SPF雞胚，購買自山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所SPF雞研究中心。

1.2 試劑

pUC57載體、DH5α感受態(tài)細胞、熒光定量PCR預混液（Master Mix）和緩沖液（Buffer），購自上海生物工程有限公司（Sangon）；Trizol、TE緩沖液、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和高保真酶PCR試劑盒，In-vitrogen公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒，購自Qiagen公司；IPTG（異丙基硫代-β-半孚L糖苷）、X-gal（5-嗅-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）和氨芐青霉素，購自寶生物工程（大連）有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物和瓊脂粉，購自O(shè)XOID公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物的設(shè)計

從GenBank下載雞IFIT5、PKR、OASL的基因序列（登錄號：XM_421662、NM_204487和NM_205041），作為引物設(shè)計的模板。利用PrimerPremier 5.0設(shè)計PCR擴增引物多對。選取β-actin基因作為內(nèi)參基因，一并設(shè)計引物。

1.4 質(zhì)粒標準品的制備

利用NDV弱毒疫苗株LaSota感染11日齡的SPF雞胚，從而激活雞胚固有免疫基因的轉(zhuǎn)錄表達。以Trizol法提取病毒感染24 h的雞胚尿囊液的總RNA，使用隨機引物法將RNA反轉(zhuǎn)錄為cD-NA。利用上述設(shè)計的引物，以cDNA為模板分別進行PCR，擴增3個基因的相應片段。對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，選取產(chǎn)物條帶單一、亮度高而且條帶大小與預期一致者，用于膠回收。將回收產(chǎn)物與pUC57載體連接，轉(zhuǎn)化人大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)細菌培養(yǎng)后挑取白色單菌落擴大培養(yǎng)，然后進行菌液PCR鑒定，將鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒菌液送上海生工生物公司測序驗證。測序結(jié)果分別與各基因的參考序列進行比對，以確定插入片段正確與否。并據(jù)此篩選出各基因的最佳擴增引物，其序列見表1。

測序正確的質(zhì)粒分別命名為pUC57-Ch-IFIT5、pUC57-Ch-PKR和pUC57-Ch-OASL。使用核酸/蛋白紫外檢測儀測定各重組質(zhì)粒的純度（OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.8左右為高純度DNA）和濃度，并換算為質(zhì)?？截悢?shù)，置于一20℃保存。質(zhì)?？截悢?shù)計算公式為：

拷貝數(shù)（拷貝/μL）=6.02×10²³×質(zhì)粒濃度（g/μL）/MW

MW（g/mol）=質(zhì)粒大?。╞p）×660g/（mol·bp）。

1.5 Q-PCR反應條件的優(yōu)化和標準曲線的繪制

以不同的退火溫度進行PCR，擴增上述3個基因，確定其共同的最佳退火溫度。然后以最佳退火溫度進行引物濃度梯度的Q-PCR，優(yōu)化各基因的引物使用量。將指數(shù)擴增開始時Ct值最小、擴增曲線為典型的S型以及擴增產(chǎn)物的熒光增量值最高的反應中使用的引物濃度作為最佳引物濃度。

分別以8個濃度梯度的pUC57-Ch-IFIT5、pUC57-Ch-PKR和pUC57-Ch-OASL為模板，使用優(yōu)化的反應體系和循環(huán)參數(shù)進行Q-PCR，繪制反應的標準曲線，建立回歸方程。

1.6 特異性試驗

對擴增產(chǎn)物進行熔解曲線的分析來驗證Q-PCR的特異性，單一產(chǎn)物表現(xiàn)為單個熔解曲線峰值。此外，使用建立的Q-PCR方法擴增對照基因，若無擴增則表明方法的特異性強。本研究中使用的對照基因樣品為本實驗室制備的13種天然免疫信號通路分子（ChMDA5、ChTLR3、ChTLR7、MAVS、TRIFF、MyD88、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-17、IFN-α、IFN-β、IFN-γ）的質(zhì)粒標準品。

1.7 敏感性試驗

將IFIT5、PKR和OASL基因的質(zhì)粒標準品做10倍梯度稀釋，分別進行Q-PCR擴增，檢測Q-PCR方法的敏感性。

1.8 重復性試驗

取5個濃度梯度的各質(zhì)粒標準品為模板分別進行Q-PCR，試驗設(shè)3個重復，計算Ct值的變異系數(shù)，檢測批內(nèi)重復性；然后，以5個濃度梯度的各質(zhì)粒標準品為模板隔天重復進行3次Q-PCR，計算Ct值的變異系數(shù)，檢測批間重復性。

1.9 Q-PCR方法檢測病毒感染雞胚IFIT5、PKR和OASL表達水平的變化

11日齡的SPF雞胚8枚，收集其中4枚的尿囊液各1mL，合并為一份檢測樣品（0h）。另外4枚雞胚經(jīng)尿囊腔途徑接種Duck/China/SDO3/2009各0.2mL。在病毒接種后24h收集尿囊液各1mL，合并作為第二份檢測樣品（24h）。Trizol法提取兩份樣品的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用建立的Q-PCR方法檢測樣品的IFIT5、PKR和OASL表達水平。每個樣品做3個重復。通過相對定量法（2^-△△Ct）計算病毒接種后各基因表達水平的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物及質(zhì)粒標準品

優(yōu)化的引物序列及相應的PCR擴增片段長度見表1。重組質(zhì)粒中各基因片段的測序結(jié)果均與GenBank中參考基因的相應序列100%符合。各質(zhì)粒的OD₂₆₀/OD₂₈₀范圍在1.8～2.0之間，表明其純度高。質(zhì)粒的濃度范圍為10⁹～10¹¹個拷貝/μL。

2.2 Q-PCR體系、循環(huán)參數(shù)及結(jié)果判定

優(yōu)化的Q-PCR反應體系（20μL）和反應條件如下：Q-PCR Master Mix 10μL，Q-PCR Buff-er 2μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板DNA2μL，雙蒸水4μL。反應程序均為：95℃預變性2.5min；95℃7s，55℃10s，72℃15s擴增45個循環(huán)，每個循環(huán)結(jié)束時檢測熒光；熔解曲線分析為95℃15s，60℃50s，95℃continuous；最后37℃30s結(jié)束。

調(diào)整熒光定量PCR的擴增基線和閾值設(shè)定，以閾值線不低于正常陰性對照擴增曲線的最高點為準。在陽性對照（質(zhì)粒標準品）為有效擴增、無模板對照（Non-template control，NTC）無擴增的前提下，讀取待測樣品的Ct值進行結(jié)果判定：Ct值大于40的樣本為陰性結(jié)果；Ct值小于或等于40的樣本為陽性結(jié)果。

2.3 Q-PCR的標準曲線及回歸方程

各基因在廣泛的濃度范圍內(nèi)均表現(xiàn)為明顯的指數(shù)擴增。由圖1可見，濃度梯度為7.5×（10～10⁸）個拷貝的Ch-IFIT5基因，其Q-PCR的Ct值在8.99～34.65之間，回歸方程為Y=-3.676X+42.32；濃度梯度為5.0×（10～10⁸）個拷貝的Ch-PKR基因，其反應的Ct值在9.51～34.27之間，回歸方程：Y=-3.559X+40.28；濃度梯度為2.0×（10²～10⁸）個拷貝的Ch-OASL基因，Q-PCR的Ct值在7.66～30.07之間，回歸方程為Y=-3.875X+40.10。

2.4 特異性檢測

雞IFIT5、PKR與OASL基因Q-PCR擴增產(chǎn)物的熔解曲線均為單一峰值（圖2）。此外，這3種基因的引物對13種與天然免疫相關(guān)的對照基因均無Q-PCR擴增，表明本研究建立的Q-PCR方法的特異性強。

2.5 靈敏度試驗

當使用建立的Q-PCR方法分別檢測8個、5個和2個拷貝的IFIT5、PKR和OASL基因時，反應的Ct平均值分別為37.48、37.65和36.82，表明該Q-PCR方法具有很高的檢測靈敏度。

2.6 重復性試驗

批內(nèi)和批間重復試驗的結(jié)果表明，Q-PCR檢測3種基因的質(zhì)粒樣品時，其Ct值的變異系數(shù)均在合理范圍內(nèi)（5%），表明方法的重復性好。

2.7 Q-PCR方法用于雞IFIT5、PKR和OASL基因檢測

雞胚尿囊液樣品中3個抗病毒蛋白基因表達水平的Q-PCR檢測結(jié)果見表2。在NDV病毒感染后24 h，PKR、OASL和IFIT5的表達水平分別比病毒接種前高出5.03、2.04倍和5.24倍，表明雞體迅速啟動了抗病毒免疫反應，以對抗病毒的感染。

3 討論與結(jié)論

抗病毒蛋白是動物機體抵抗病毒感染的效應物質(zhì)，因此，相比檢測干擾素或細胞因子的表達水平，對雞體抗病毒蛋白進行檢測更能夠直接地反映雞體的抗病毒免疫水平。本研究建立了檢測雞體三種抗病毒蛋白PKR、OASL和IFIT5基因轉(zhuǎn)錄水平的SYBR Green I熒光定量PCR方法，可用于檢測病毒感染或者疫苗、藥物作用后雞體免疫系統(tǒng)的應答變化，從而有助于闡明病毒的致病機制，在雞用新型疫苗、免疫增強劑以及抗病毒藥物的研究與開發(fā)中發(fā)揮作用。

本研究建立的方法具有靈敏度高、特異性強、檢測線性濃度范圍廣、重復性好、操作簡便及省時等優(yōu)點，可用于相應基因的絕對或相對定量檢測。應用該方法，成功檢測到新城疫病毒感染雞胚后尿囊液中PKR、OASL和IFIT5基因表達上調(diào)。