趙亞碩 李硯超 杜立波 趙保路 劉揚(yáng) 常彥忠

[摘 要] 目的 探討L-精氨酸（L-Arginine，L-Arg）和天然抗氧化劑搭配組合對(duì)腦卒中的防治作用。方法 分別建立細(xì)胞的氧糖剝奪（oxygen and glucose deprivation，OGD）模型和小鼠的大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型來模擬腦缺血，通過L-Arg和天然抗氧化劑搭配預(yù)處理之后分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（scavenge reactive oxygen species，ROS）水平、細(xì)胞凋亡及信號(hào)分子的表達(dá)。結(jié)果 低濃度L-Arg對(duì)細(xì)胞活力沒有影響，但高濃度L-Arg能損傷細(xì)胞并影響B(tài)cl-2和Bax表達(dá)。L-Arg和天然抗氧化劑搭配組合能夠減輕OGD誘導(dǎo)細(xì)胞的損傷，對(duì)細(xì)胞活力有明顯保護(hù)作用，清除OGD引起的細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS增加，減少細(xì)胞凋亡和線粒體膜損傷并調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax、caspase3的表達(dá)；在小鼠的MCAO模型中研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，這個(gè)組合可以減輕局灶性腦缺血引起的腦組織損傷和腦組織細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達(dá)。結(jié)論 L-Arg和天然抗氧化劑搭配可以減少缺氧和缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞和動(dòng)物腦組織的損傷，可能對(duì)腦卒中有一定的防治作用。

[關(guān)鍵詞] 一氧化氮；天然抗氧化劑；氧糖剝奪；缺血性腦卒中；細(xì)胞凋亡

中圖分類號(hào)：R743.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1009-816X（2016）04-0259-05

[Abstract] Objective To study the preventive and therapeutic effects of L-Arginine （L-Arg） and natural antioxidants on ischemic stroke. Methods The model of oxygen and glucose deprivation （OGD） on cell and the model of Middle Cerebral Artery Occlusion （MCAO） on mice were established to simulate ischemic stroke. Reactive oxygen species （ROS） levels， apoptosis and signaling molecules in cell were detected respectively by a pretreatment with L-Arg and natural antioxidants. Results In vitro， a low concentration of L-Arg showed no effect on the cell vitality， but a high level of L-Arg could impair the cell and affect the expression of Bcl-2 and Bax. A reasonable combination of L-Arg and natural antioxidants could decrease OGD-induced cell damage and provide obvious protection on cell vitality by scavenging reactive oxygen species （ROS）， reducing apoptosis and mitochondrial membrane as well as modulating the expression of related proteins Bcl-2，Bax and caspase-3. In the study of the MCAO model on mice， we further discovered that this combination of L-Arg and natural antioxidants could decrease damage and the apoptosis of brain tissue， and modulate the expression of related proteins Bcl-2 and Bax induced by the focal brain ischemia. Conclusions Since a reasonable combination of L-Arg and natural antioxidants can reduce the damage of nerve cells and animal brain tissue induced by hypoxia and ischemia， it might be beneficial to the prevention and treatment of ischemic stroke.

[Key words] Nitric oxide （NO）； Natural antioxidants； Oxygen and glucose deprivation （OGD）； Ischemia stroke； Apoptosis

我國(guó)已經(jīng)進(jìn)入老齡化社會(huì)，目前全國(guó)患有腦卒中，老年癡呆癥，心臟病，加上高血脂、高血糖和高血壓的人群有3億多，這嚴(yán)重影響著中國(guó)人民的健康水平。近年來，我國(guó)的腦卒中發(fā)病率急劇上升，如果治療不及時(shí)就會(huì)造成長(zhǎng)久的運(yùn)動(dòng)障礙甚至是死亡，對(duì)家庭和社會(huì)帶來巨大的壓力和負(fù)擔(dān)，這將是人們面臨的一個(gè)嚴(yán)峻的醫(yī)療和社會(huì)問題。因此，如何預(yù)防和治療腦卒中，不僅是醫(yī)療工作者的責(zé)任，也是科學(xué)研究和健康戰(zhàn)線的一個(gè)艱巨任務(wù)。

一氧化氮（NO）是內(nèi)皮細(xì)胞松弛因子，對(duì)血壓的調(diào)節(jié)和心血管健康發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)利用天然抗氧化劑保護(hù)心肌缺血再灌注損傷時(shí)，發(fā)現(xiàn)天然抗氧化劑可以清除缺血再灌注損傷時(shí)產(chǎn)生的氧自由基，調(diào)節(jié)和促進(jìn)NO自由基產(chǎn)生，進(jìn)而保護(hù)心肌組織，減弱缺血再灌注損傷[1～4]。經(jīng)過試驗(yàn)，我們將一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）的底物L(fēng)-精氨酸（L-Arginine，L-Arg）和天然抗氧化劑搭配以后，形成了一個(gè)NO和天然抗氧化劑搭配組合，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞體系和動(dòng)物組織體系中，既可以產(chǎn)生一定量的NO，又可以清除細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS），從而保護(hù)細(xì)胞和組織[5]。

我們建立了氧糖剝奪（oxygen and glucose deprivation，OGD）的細(xì)胞模型和小鼠的大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型來模擬體外腦缺血，研究了L-Arg和天然抗氧化劑搭配組合對(duì)腦卒中的防治作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料：L-Arg購(gòu)自美國(guó)Sigma Chemical公司。山楂提取物、知母提取物和蝦青素購(gòu)自西安清樂生物科技有限公司。將精氨酸、山楂提取物、知母提取物和蝦青素按一定比例混合，溶于蒸餾水中，以灌胃的方式喂食動(dòng)物。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法：細(xì)胞培養(yǎng)和處理：選取人的SH-SY5Y神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，建立細(xì)胞的OGD模型來模擬體外腦缺血[6]。用無糖培養(yǎng)基，在無氧的條件下（95% N2+5% CO2）培養(yǎng)細(xì)胞。測(cè)試L-Arg、L-Arg和天然抗氧化劑搭配組合對(duì)細(xì)胞進(jìn)行OGD培養(yǎng)的影響。利用MTT（3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di-phenytetrazoliumromide）法測(cè)定細(xì)胞活力；采用DCF-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS水平；采用Rhodamine123染色法測(cè)定線粒體膜電位；利用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡；細(xì)胞內(nèi)Bcl-2，Bax和caspase-3的表達(dá)測(cè)試采用western-blot方法。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：選用20～25g左右C57BL/6健康雄性小鼠，建立腦中動(dòng)脈局灶性腦缺血模型。將長(zhǎng)25mm直徑為0.20+0.01mm的線栓，置于1：2500單位的肝素生理鹽水中備用。將小鼠一側(cè)的頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈識(shí)別并游離；將頸外動(dòng)脈結(jié)扎并剪斷，將線栓插入到頸外動(dòng)脈，通過頸內(nèi)動(dòng)脈到達(dá)腦中動(dòng)脈，線栓插入感覺遇到阻力即可，插入的深度大約10mm左右，這樣完成小鼠的局灶性腦缺血MCAO模型。缺血60min之后，將線栓從頸內(nèi)動(dòng)脈拔出，實(shí)現(xiàn)血流再循環(huán)，完成血液再灌注過程。將小鼠隨機(jī)分成三組：對(duì)照處理組、L-Arg和天然抗氧化劑搭配組合高劑量組（18mg/d），低劑量組（4.5mg/d），其中對(duì)照組灌胃等體積的蒸餾水，每組10例。先將這三組小鼠分別進(jìn)行灌胃處置10d，之后進(jìn)行MCAO處理60min 再灌注24h。觀察三組小鼠的神經(jīng)學(xué)評(píng)價(jià)、腦部梗塞面積、Tunel染色，同時(shí)用western-blot檢測(cè)凋亡相關(guān)分子的表達(dá)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)用Statisic 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)表達(dá)均為（x-±s），多組之間的差異采用單因素方差分析檢驗(yàn)，兩兩比較采用T-test檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外源性的L-Arg對(duì)的細(xì)胞活活力影響：在SH-SY5Y細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的L-Arg能夠產(chǎn)生少量的NO，對(duì)細(xì)胞活力沒影響，而高濃度L-Arg反而對(duì)細(xì)胞造成不利的影響（圖1A），并能夠影響B(tài)cl-2和Bax蛋白的變化（圖1B）。圖1 L-Arg對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞活力及凋亡的影響。

2.2 L-Arg和天然抗氧化劑搭配組合對(duì)細(xì)胞活力有明顯保護(hù)作用：在SH-SY5Y細(xì)胞的OGD模型中研究發(fā)現(xiàn)，L-Arg和天然抗氧化劑搭配組合對(duì)細(xì)胞活力有明顯保護(hù)作用（圖2A）。安全有效的藥物組合濃度（10μg/ml）不僅對(duì)OGD誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有防護(hù)作用（圖2B），同時(shí)還能對(duì)OGD誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Bcl-2降低和cleaved-caspase-3升高有明顯抑制作用（圖2C-D）。圖2 L-Arg和天然抗氧化劑搭配組合對(duì)細(xì)胞進(jìn)行OGD培養(yǎng)體外模擬缺血性腦中風(fēng)模型細(xì)胞活性的影響。

2.3 L-Arg和天然抗氧化劑搭配組合對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS和NO的影響：在SH-SY5Y細(xì)胞的OGD模型中研究發(fā)現(xiàn)，安全有效的藥物組合濃度（10μg/ml）能夠使細(xì)胞產(chǎn)生NO（圖3A）。研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，安全有效的藥物組合濃度還能夠抑制細(xì)胞內(nèi)由于OGD產(chǎn)生的ROS（圖3B）和線粒體膜電位的改變（圖3C）。圖3 L-Arg和天然抗氧化劑搭配組合對(duì)細(xì)胞內(nèi)NO、ROS和MMP的影響。

2.4 L-Arg和天然抗氧化劑搭配組合對(duì)小鼠的局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用：通過小鼠的MCAO模型研究發(fā)現(xiàn)，利用L-Arg和天然抗氧化劑搭配組合能顯著地改善小鼠的神經(jīng)行為學(xué)損傷（圖4A），腦梗死面積減弱（圖4B）。進(jìn)一步的研究表明，L-Arg和天然抗氧化劑搭配組合能夠顯著地降低缺血損傷側(cè)凋亡細(xì)胞的數(shù)量（圖5A），同時(shí)能夠抑制Bcl-2的降低和Bax的上升（圖5B，C），并且低劑量要明顯好于高劑量。圖4 L-Arg和天然抗氧化劑搭配組合預(yù)處理對(duì)MCAO小鼠神經(jīng)學(xué)評(píng)分和梗死面積的影響。

從以上細(xì)胞和動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果來看，L-Arg和天然抗氧化劑搭配組合對(duì)神經(jīng)細(xì)胞缺氧損傷和動(dòng)物腦缺血再灌注損傷都具有較好的防護(hù)作用，對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞的損傷的保護(hù)作用是通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生NO和清除ROS水平及調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax和caspase-3實(shí)現(xiàn)的。

3 討論

NO在生物體內(nèi)承擔(dān)著重要的生物功能，NO作為內(nèi)皮細(xì)胞松馳因子，具有舒張血管調(diào)節(jié)血壓的功能[7]。NO是一個(gè)重要的細(xì)胞通信信號(hào)，具有神經(jīng)生理及神經(jīng)保護(hù)作用，特別是對(duì)神經(jīng)生存和分化發(fā)揮著重要作用。對(duì)各種損傷導(dǎo)致細(xì)胞死亡的危險(xiǎn)因素，可以提供不同通路且對(duì)細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用。NO可以通過調(diào)節(jié)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖和促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。在一些模型體系的研究都清楚地證明了NO具有神經(jīng)生理及神經(jīng)保護(hù)作用[8～11]。但NO的生物效應(yīng)具有兩面性，除具有神經(jīng)生理及神經(jīng)保護(hù)作用外，當(dāng)它在腦中以高濃度產(chǎn)生時(shí)，可以介導(dǎo)一系列神經(jīng)病理過程，如神經(jīng)退行性疾病、炎癥及腦缺血再灌注造成損傷[1～4]。

山楂的果實(shí)、葉子、花都可入藥，包含多種化學(xué)成分，如：黃酮類物質(zhì)，原花青素類（即OPC），有機(jī)酸類，三萜酸類，甾酮類等。山楂提取物可以治療早期充血性心力衰竭、心絞痛、心律不齊、高血壓、高脂血癥等[12]?，F(xiàn)在藥理試驗(yàn)表明，山楂提取物可能通過抑制磷酸二酯酶的活性，增加冠狀動(dòng)脈血液流量和心臟的血液輸出，減少心臟的耗氧量，保護(hù)心腦組織免受缺血再灌注損傷。

蝦青素（3，3'-二羥基-beta，beta-胡蘿卜素-4，4'-二酮）屬類胡蘿卜素，是存在于魚、蝦和藻類中的一種強(qiáng)抗氧化劑，其抗氧化活性大于beta-胡蘿卜素的10倍、維生素E的100倍。近年對(duì)蝦青素功能的研究使我們對(duì)其生物活性有了更多的認(rèn)識(shí)。體外實(shí)驗(yàn)顯示，在神經(jīng)細(xì)胞模型中，蝦青素可以降低6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、線粒體損傷和細(xì)胞凋亡。在腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭?，蝦青素通過抑制氧化應(yīng)激、減少谷氨酸釋放和細(xì)胞凋亡、降低大腦的自由基損傷、神經(jīng)退化和腦梗死[13，14]。

知母的有效成分是知母寧，其化學(xué)名稱為2C-β-D-吡喃葡糖-1，3，6，7-四氫羥基-9H-黃素-9-酮。知母寧含有四個(gè)酚羥基的多酚類物質(zhì)。知母寧具有清熱瀉火，滋陰潤(rùn)燥，退熱消炎，抑菌殺菌，降血糖等作用，最近人們建議把它用于治療心臟病。知母寧對(duì)氧自由基有很強(qiáng)的清除作用，它對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷過程產(chǎn)生的一氧化氮自由基和氧自由基的清除作用以及對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)效應(yīng)[2，4，5]。

我們將L-Arg和天然抗氧化劑山楂提取物、知母寧和蝦青素的搭配以后，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞體系和組織體系中，L-Arg在細(xì)胞和組織內(nèi)可以產(chǎn)生一定量的NO，而在缺氧缺血過程會(huì)產(chǎn)生ROS，二者結(jié)合形成過氧亞硝基，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞組織損傷。天然抗氧化劑山楂提取物、知母寧和蝦青素可以清除缺氧缺血過程會(huì)產(chǎn)生ROS，產(chǎn)生具有保護(hù)作用的NO，發(fā)揮松弛血管和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。缺氧缺血過程會(huì)產(chǎn)生不同種類的ROS，有大有小、有水溶、也有脂溶。山楂提取物、知母寧和蝦青素各含有不同天然抗氧化劑，它們可以在水溶和脂溶體系中清除不同ROS，保護(hù)和促進(jìn)產(chǎn)生安全的NO，相互有一定的協(xié)同作用，保護(hù)了神經(jīng)細(xì)胞，防止缺氧缺血對(duì)神經(jīng)細(xì)胞和組織的損傷[4，5]。另外，NO和天然抗氧化劑本身就能夠提高機(jī)體對(duì)ROS的損傷作用[8，15]。NO和天然抗氧化劑還可能參與其他血象改變，比如增加循環(huán)中的網(wǎng)狀紅細(xì)胞、白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，NO是自然殺傷細(xì)胞NK的調(diào)節(jié)劑，可以調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的功能，能提高或抑制肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的活化[16，17]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，這個(gè)L-Arg和天然抗氧化劑搭配組合對(duì)局部腦缺血引起的腦卒中確實(shí)具有較好的防護(hù)作用，而且L-Arg和天然抗氧化劑搭配組合對(duì)于局部腦缺血引起的腦組織和神經(jīng)細(xì)胞的損傷的保護(hù)作用，清除局部腦缺血引起的細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS，還可以調(diào)節(jié)局部腦缺血引起的凋亡蛋白Bcl-2，Bax，caspase3表達(dá)的影響。這可能L-Arg和天然抗氧化劑的搭配組合提高了動(dòng)物的整體健康水平而發(fā)揮的作用。這也為研制和開發(fā)保護(hù)神經(jīng)、防治腦卒中的健康食品和藥物提供了有價(jià)值的參考。

參考文獻(xiàn)

[1]Shen JG， Wang J， Zhao BL， et al. Effects of EGb-761 on nitric oxide， oxygen free radicals， myocardial damage and arrhythmias in ischemia-reperfusion injury in vivo[J]. Biochim Biophys Acta，1998，1406（3）：228-236.

[2]Shen JG， Guo XS， Jiang B，et al. Chinonin，a novel drug against cardiomyocyte apoptosis induced by hypoxia and reoxygenation[J]. Biochim Biophyscs Acta，2000，1500（2）：217-226.

[3]Zhang DL， Zhao BL. Oral administration of Crataegus extraction protects against ischemia/reperfusion brain damage in the Mongolian gerbils[J]. J Neur Chem，2004，90（1）：211-219.

[4]Zhao BL， Shen J-G， Li M， et al. Scavenging effect of Chinonin on NO and oxygen free radicals and its protective effect on the myocardium from the injury of ischemia-reperfusion. Biochem[J]. Biophys Acta，1996，1315（2）：131-137.

[5]Zhao BL. “Double Edge” Effects of Nitric Oxide Free Radical in Cardio-Brain-Vascular Diseases and Health Studied by ESR[J]. Chinese Journal of Mag-netic Resonance，2015，32（2）：195-207.

[6]Wu Z， Zhu Y， Cao X， et al. Mitochondrial Toxic Effects of Aβ Through Mitofusins in the Early Pathogenesis of Alzheimer's Disease[J]. Molecular Neurobiology，2014，50（3）：986-996.

[7]Palmer RM， Ferrige AG， Moncada S， et al. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor[J]. Nature，1987，327（6122）：524-526.

[8]趙保路.一氧化氮自由基[M].北京：科學(xué)出版社， 2008：212-214，335-362.

[9]Contestabile A， Ciani E. Role of nitric oxide in the regulation of neuronalproliferation，survival and differentiation[J]. Neurochemistry International，2004，45（6）：903-914.

[10]Guo S， Yan J， Bezard E， et al. Protective effects of green tea polyphenols in the 6-OHDA rat model of Parkinson's disease through inhibition of ROS-NO pathway[J]. Biological Psychiatry，2007，62（12）：1353-1362.

[11]Shi ZH， Nie G，Duan XL， et al. Neuroprotective mechanism of mitochondrial ferritin on 6-hydroxydopamine induced dopaminergic SH-SY5Y cell damage： potential implication for neuroprotection in Parkinson's disease[J]. Antioxidants & Redox Signaling，2010，13（6）：1805-1818.

[12]Popping S， Rose H， IonescuI， et al. Effect of a hawthorn extract on contraction and energy turnover of isolated rat cardiomyocytes[J]. Arzneimittel-Forschung，1995，45（11）：1157-1161.

[13]Weihmayr T， Emst E. Therapeutic effectiveness of crataegus[J]. For-schritte der Medizin，1996，114（1-2）：27-29.

[14]Lin T， Lu C， Wang S. Astaxanthin inhibits glutamate release in rat cerebral cortex nerve terminals via suppression of voltage-dependent Ca2+ entry and mitogen-activated protein kinase signaling pathway[J]. J Agric Food Chem，2010，58（14）：8271-8278.

[15]Malvezi AD， Cecchini R， Souza F， et al. Involvement of nitric oxide（NO）and TNF-α in the oxidativestress associated with anemia in experimental Trypanosoma cruzi infection[J]. FEMS Immun Med Microbiol，2004，41（1）：69-77.

[16]Bidri M， Feger F， Varadaradjalou S， et al. Mast cells as a source and target for nitric oxide[J]. Int Immunopharmacol，2001，1（8）：1543-1558.

[17]Niedbala W， Wei XQ， Piedrafita D， et al. Effects of nitric oxide on the induction and differentiation of Th1 cells[J]. Eur J Immunol，1999，29（8）：2498-2505.