和東陽，牛延菲，徐 怡，秦 波，游 燕

(云南省藥物研究所，云南白藥集團創(chuàng)新研發(fā)中心，云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點實驗室，云南 昆明 650111)

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高效液相色譜法測定三七藥材中硝酸鹽含量

和東陽，牛延菲，徐 怡，秦 波，游 燕

(云南省藥物研究所，云南白藥集團創(chuàng)新研發(fā)中心，云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點實驗室，云南 昆明 650111)

高效液相色譜；三七藥材；硝酸鹽；含量測定

眾所周知，日攝入硝酸鹽含量超過正常負荷時，將會危害人體健康[1]，但硝酸鹽廣泛存在于自然環(huán)境中，為植物天然成分之一[1]。硝酸鹽在人體內還原成亞硝酸鹽后，如果累積量過多，可導致高鐵血紅蛋白癥，還可與人體內的胺類物質發(fā)生反應，形成強力致癌物質，誘發(fā)消化系統(tǒng)癌變[2-3]。目前常用酚二磺酸法、鎘柱還原分光光度法、紫外分光光度法、離子色譜等方法來測定硝酸鹽含量。本文采用高效液相色譜法，選擇四丁基溴化銨作為離子對試劑，利用四丁基溴化銨與硝酸根陰離子形成中性締合物，在乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀-磷酸溶液為流動相中，被非極性鍵合柱(ODS)分離并定量測定。

1 儀器、試劑和藥材

1.1 儀 器

E2695高效液相色譜儀(二極管陣列檢測器)，美國Waters；AG285型電子天平，瑞典METTLER TOLEDO公司；Milli-Q Advantage A10制水機，XMTD-4000 電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.2 試劑和藥材

硝酸鹽對照品溶液(BW3058，1000 mg/L)，中國計量科學研究院；甲醇、乙腈均為色譜純(默克)、硼酸鈉(AR)，天津市化學試劑三廠；磷酸二氫鉀(AR)，國藥集團化學試劑科技有限公司；磷酸(AR)，天津市科密歐化學試劑有限公司；四丁基溴化銨(AR)，國藥集團化學試劑三廠；水為超純水，美國Milli-Q公司。

三七藥材，均由文山三七花公司提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Utimate pheny1-ether(150 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相：乙腈：0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液+0.03 mmol/L四丁基溴化銨+磷酸(稱取6.8045 g磷酸二氫鉀溶于1000 mL水中，加入0.944 g四丁基溴化銨，再用磷酸調pH=3.2)=10:90；流速1.0 mL/min；檢測波長：216 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

精密吸取硝酸鹽對照品溶液(中國計量科學研究院，BW3058，1000 mg/L)1.0 mL于10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，在逐級稀釋至C=0.005 mg/mL，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取三七粗粉5.0 g加入5.0 mL超純水于100 mL燒杯中，用玻璃棒攪拌制成勻漿，再往燒杯中加入12.5 mL硼砂飽和液攪拌均勻，以70 ℃左右的水約150 mL將試樣轉入250 mL容量瓶中，于沸水浴中加熱20 min，取出后冷卻至室溫，然后加超純水至刻度，搖勻，靜置片刻。再經0.45 μm濾膜濾過取濾液，待測。

2.2.3 空白溶液的制備

直接往250 mL容量瓶中加入70 ℃左右的超純水約150 mL再加入12.5 mL硼砂飽和液搖勻，于沸水浴中加熱20 min，取出后冷卻至室溫，然后加超純水至刻度，搖勻，靜置片刻。再經0.45 μm濾膜濾過取濾液，待測。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

按“2.2”項下供試品溶液的制備方法制備對照品溶液、供試品溶液、供試品溶液+對照品溶液和空白溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定記錄色譜圖，結果見圖1。由圖1可知供試品溶液色譜與對照品溶液色譜在相同的位置上有相同的色譜峰出現(xiàn)，而空白溶液無此峰出現(xiàn)，表明三七藥材的其他成分對硝酸鹽成分的含量測定無干擾。另取硝酸鹽對照品適量加入供試品溶液中，搖勻，照上述色譜條件進行測定，所得色譜圖中，硝酸鹽峰面積明顯增大，其它色譜峰面積變化不大，比較對應色譜峰的吸收光譜，具一致性，說明該色譜峰為硝酸鹽的信號。

圖1 系統(tǒng)適用性

2.4 線性關系考察

分別精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液配制并逐級稀釋配制成一系列濃度的對照品溶液(見表1)，分別進樣10 μL，測定峰面積，以對照品的進樣量(mg)為橫坐標，峰面積為縱坐標計算得回歸方程見為y=14637841.30x+84017 (r=0.9999)，對照品含量5～500 μg范圍峰面積呈良好的線性關系。

表1 線性關系測定結果

2.5 檢測限及定量限

取上述儲備液用超純水稀釋配制成一系列濃度的對照品溶液，分別進樣，以信噪比3倍和10倍作為指標，考察硝酸鹽含量的檢測限(LOD)和定量限(LOQ)，結果見表2。

表2 硝酸鹽含量的檢測限和定量限

2.6 精密度試驗

取配制好的硝酸鹽對照品溶液(0.005 mg/mL)，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6針，進樣量10 μL。結果，以峰面積計算，峰面積平均值為832706.7，RSD=1.3%(n=6)，結果表明本法儀器精密度較為良好。

2.7 樣品重復性

精密稱取同一批次三七藥材(批號：20150426)6份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，進樣量10 μL。結果，三七藥材中硝酸鹽的平均含量為187.6 μg/g(RSD=1.5%)，表明該方法重復性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取同一份三七藥材(批號：20150426)供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進樣，進樣量10 μL，分別于0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進樣，結果，平均峰面積為885362.3，RSD=1.4%(n=7)，表明供試品溶液中硝酸鹽在24 h內較穩(wěn)定。

2.9 加樣回收試驗

精密稱取同一批次已知含量供試品9份(已測硝酸鹽平均含量為187.6 μg/g，每份約2.5 g，對照品硝酸鹽堿濃度0.1 mg/mL)，然后按“2.2”項下供試品溶液制備方法同法處理，將處理好的供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進樣，進樣量10 μL，進行測定。計算平均回收率為100.2%，RSD=1.6% (n=9)。結果見表3。

表3 加樣回收率測定結果

2.10 樣品測定

表4 樣品測定結果

取6個不同批次三七藥材，按“2.2”供試品溶液制備法制備供試品，按“2.1”項色譜條件進樣，進樣量10 μL，進行測定。結果見表4。

3 討 論

本法應用反相高效液相色譜-二極管陣列檢測器法測定三七中硝酸鹽的含量，不需要經過鎘柱還原，具有快速、準確、靈敏、簡便等優(yōu)點，三七中其它成分對其檢測均不形成干擾。此外，色譜條件的選擇上，筆者曾比較了甲醇-水、 甲醇-乙腈-水為流動相，雖分離度都能達到要求，但在同一色譜柱上甲醇-乙腈-水柱壓較低，保留時間適當，峰形更好。對已具備了高效液相色譜儀的實驗室，本方法擴展了儀器的檢測范圍，并且大大提高工作效率，值得推廣使用，同時本法也適用于其他藥材及產品的硝酸鹽含量測定。

[1] 楊華梅.反相高效液相色譜法測定蔬菜鮮樣中硝酸鹽[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學，2008, 35(3):543-544.

[2] 蔡志斌,張英,劉麗.高效液相色譜快速測定乳粉中硝酸鹽和亞硝酸鹽[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2009(3):584-585.

[3] 張秋菊,崔世勇,姜麗華,等.反相高效液相色譜法同時測定醬腌菜中亞硝酸鹽和硝酸鹽[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,，2008,18(7):1304-1305.

[4] 國家藥典委員會.中國藥典.一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2015:11-12.

[5] 鞠穎,廖輝.三七活血化瘀作用析要[J].河南中醫(yī)，2013(4):592-594.

[6] 歐小宏,張智慧,鄭冬梅,等.氮肥運籌對二年生三七產量、品質及養(yǎng)分吸收與分配的影響[J].中國現(xiàn)代中藥,2014,16(12):1000-1005.

Determination of Nitrate Content in Panax Notoginseng by HPLC

HEDong-yang,NIUYan-fei,XUYi,QINBo,YOUYan

(Yunnan Institute of Materia Medica, Yunnan Baoyao Group Innovation and R&D Center, Yunnan Province Company Key Laboratory for TCM and Ethnic Drug of New Drug Creation, Yunnan Kunming 650111, China)

The determination of the nitrate content in Panax notoginseng by HPLC was discussed. The separation was performed with tetrabutyl ammonium (TBABr) dissolved in acetonitrile-0.05 mol/L monopotassium phosphate (KH2PO4) (10:90) buffer as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min and accomplished with utimate phenyl-ether(150 mm×4.6 mm，5 μm) column at 30 ℃. The detection wavelength was 216 nm and the injection volume was 10 μL. Under the detection conditions, the nitrate content in Panax notoginseng showed good linearity(r=0.9998). The recovery rate was 100.2%(n=9), RSD=1.6%(n=9). This method is simple, rapid, accurate, reliable and reproducible. It is suitable for detecting various contents of nitrate in Panax notoginseng.

high performance liquid chromatography; Panax notoginseng; nitrate; content determination

和東陽(1987-)，男，碩士，助理工程師，主要從事中藥質量標準制訂。

游燕(1976-)，女，高級工程師，主要從事中藥質量標準制訂。

R927.2

A

1001-9677(2016)020-0090-03