魏 興， 王春江， 曹 波， 孫強穩(wěn)

(1.包頭醫(yī)學院，內(nèi)蒙古包頭 014060；2.包頭市第四醫(yī)院骨四科；3.武警后勤學院救援醫(yī)學系生藥學教研室)

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鬼臼毒素衍生物SQW-76誘導人骨肉瘤細胞凋亡及其機制*

魏 興1， 王春江2， 曹 波3， 孫強穩(wěn)3

(1.包頭醫(yī)學院，內(nèi)蒙古包頭 014060；2.包頭市第四醫(yī)院骨四科；3.武警后勤學院救援醫(yī)學系生藥學教研室)

目的：研究鬼臼毒素衍生物SQW-76對人骨肉瘤U-2 OS細胞的抗腫瘤活性并探討其機制。方法：噻唑藍(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)法檢測SQW-76及陽性對照藥物依托泊苷(VP-16)和阿霉素(adriamycin,ADM)對U-2 OS細胞和成纖維細胞體外增殖的抑制作用及對U-2 OS細胞生長曲線的影響；異硫氰酸熒光素-碘化丙啶(fluorescein isothiocyanate-propidium iodide，F(xiàn)ITC-PI)雙染行流式細胞術(shù)測細胞凋亡；聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)檢測SQW-76對U-2 OS細胞凋亡相關(guān)基因表達的影響；caspase總抑制劑及caspase-3抑制劑對SQW-76誘導U-2 OS細胞凋亡的影響；JC-10線粒體膜電位檢測法測SQW-76對U-2 OS細胞凋亡線粒體通路的影響；檢測Caspase-3蛋白活性。結(jié)果：SQW-76在體外對U-2 OS細胞抑制作用明顯，IC50值為(6.18±0.3)μmol/L，流式細胞術(shù)檢測SQW-76通過凋亡途徑抑制細胞，PCR發(fā)現(xiàn)給藥后Caspase-3、caspase-9 mRNA表達水平上調(diào)，加入Caspase總抑制劑可明顯抑制細胞凋亡，加入Caspase-3抑制劑可輕微抑制細胞凋亡，給藥后線粒體膜電位降低，Caspase-3蛋白活性增高。結(jié)論：SQW-76在體外試驗抗骨肉瘤細胞作用明顯且體細胞毒性低于陽性藥物VP-16、ADM，其可能通過影響caspase-9、caspase-3相關(guān)基因誘導線粒體凋亡通路誘導U-2 OS細胞凋亡。

鬼臼毒素衍生物；骨肉瘤；U-2 OS細胞；細胞凋亡；抗腫瘤

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，約占所有骨腫瘤的60 %。骨肉瘤化療的整體有效率仍在60 %左右，主要原因是化療藥不良反應和腫瘤細胞耐藥問題。其他原因包括二線化療藥的缺乏、化療風險評估、化療新方案等仍待解決。鬼臼毒素是從小蘗科鬼臼屬植物-華鬼臼的根和莖中提取到的木脂類抗腫瘤成分[1]。由鬼臼毒素結(jié)構(gòu)改造所得的衍生物依托泊苷和替尼泊苷已經(jīng)成為臨床上常用的拓撲異構(gòu)酶II(topoisomerase,Topo II)制劑，在臨床上得以廣泛應用。但仍存在抗癌譜窄、水溶性差及較嚴重的骨髓抑制與胃腸道反應等缺點[2]。SQW-76是本課題組對鬼臼毒素結(jié)構(gòu)加以改造所研制的新型化合物。本研究以鬼臼毒素衍生物依托泊苷(VP-16)和臨床抗腫瘤藥阿霉素(adriamycin,ADM)為陽性對照藥，以人骨肉瘤細胞U-2 OS為實驗對象進行了一系列研究，探索SQW-76對骨肉瘤細胞的抗腫瘤活性及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 細胞株 U-2 OS人骨肉瘤細胞，由中國科學院細胞庫提供。成纖維細胞購自凱基生物公司。

1.1.2 藥物及試劑 SQW-76，分子量602.87，為鬼臼毒素結(jié)構(gòu)改造獲得，由武警后勤學院生藥學教研室合成，純度>95 %。依托泊苷(VP-16)，分子量588.56，為中國藥品生物制品檢定所標準品，批號：100388-201301。ADM分子量579.99，江蘇輝瑞，國藥準字H20093251。RPMI-1640(天津百若克)，胎牛血清(中國醫(yī)學科學院血研所)，溴化四氮唑藍(Sigma公司)，四甲基乙二胺、Tris Base、Tris HCl、二甲基亞砜購自CotyBioTech公司。Annexin-V Binding Buffer、異硫氰酸熒光素-碘化丙啶(fluorescein isothiocyanate-propidium iodide，F(xiàn)ITC-PI)、Annexin-V、Propidium Iodide Solution為美國BioLegend公司產(chǎn)品。Caspase總抑制劑Z-VAD-FMK、Caspase-3抑制劑Ac-DEVD-CHO(碧云天)。RT-PCR試劑盒(大連寶生物資源有限公司)。JC-10細胞凋亡線粒體膜電位檢測試劑盒(南京凱基)，Caspase-3活性檢測試劑盒(碧云天)。

1.2 方法[2]

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人骨肉瘤細胞U-2 OS，人成纖維細胞在RPMI-1640培養(yǎng)基中(含10 %胎牛血清，100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法測SQW-76對U-2 OS的抗腫瘤活性：人骨肉瘤細胞U-2 OS細胞，取對數(shù)生長期細胞接種于96孔板內(nèi)，每孔約8 000個細胞，置于37 ℃，5 %CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后加入不同濃度的陽性對照藥ADM、VP-16和鬼臼毒素衍生物SQW-76(終濃度10、1、0.1、0.01 μmol/L)，每個濃度組設3復孔，另設陰性對照組加入與給藥組等體積的培養(yǎng)液。放入孵箱中培養(yǎng)后加MTT，37 ℃培養(yǎng)4 h后，棄上清加二甲基亞礬150 μL，測定490 nm光密度值，計算IC50值。

1.2.3 Hoechst33342/PI/Annexin V-FITC染色 U-2 OS細胞接種96孔板并分濃度梯度給藥后48 h，用Hoechst33342/PI/Annexin V-FITC染色來觀察給藥后細胞形態(tài)變化及細胞凋亡情況。Hoechst33342(終濃度10 μg/mL)，染色5～10 min，PBS洗滌后加入Annexin V-FITC(終濃度10 μg/mL)、PI(終濃度10 μg/mL)，染色5 min，PBS洗滌后加入PBS 100μL，用GE In Cell Analyzer 2000高內(nèi)涵細胞成像分析系統(tǒng)觀察并分析。

1.2.4 流式細胞儀側(cè)SQW-76對U-2 OS細胞凋亡的影響 U-2 OS細胞接種于6孔板內(nèi)，24 h后分別加入SQW-76(終濃度4,6,8 μmol/L)及ADM和VP-16(終濃度6 μmol/L)，對照組加入等量培養(yǎng)基，48 h后收集細胞，Annexin V-FITC/PI雙染后室溫孵育30 min，流式細胞儀測定細胞凋亡。

1.2.5 噻唑藍(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)法測caspase-3抑制劑和caspase總抑制劑合并SQW-76對U-2 OS細胞的影響 取對數(shù)生長期U-2 OS細胞接種于96孔板內(nèi)，24 h后分3組，分別加入caspase-3抑制劑Ac-DEVD-CHO(終濃度20 μM)、caspase總抑制劑Z-VAD-FMK(終濃度20 μM)和等量培養(yǎng)基孵育30 min，然后3組均加入SQW-76(終濃度4、6、8 μmol/L),對照組加入等量培養(yǎng)基。48 h后用MTT法測吸光度值，并觀察caspase-3、caspase總抑制劑對SQW-76的影響。

1.2.6 SQW-76對U-2 OS細胞基因的影響 對數(shù)生長期細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板，接種24 h后，分別加入SQW-76(終濃度4、6、8 μmol/L)及對照藥VP-16和ADM(終濃度6 μmol/L)，48 h后收集細胞，用Biozol法提取總RNA，RCR分析：β-actin作為內(nèi)標，目的基因caspase-3(引物序列F:5'-TGGCATTGAGACAGACA-3'，R:5'-GGCACAAAGCGACTG-3')、caspase-9(引物序列F: AGACCAGAGATTCGCAAAC-3'，R:5'-TTCCTGGAACGGGGTGGCAT-3')、caspase-8(引物序列F:5'-CCAGAGACTCCAGGAAAAGAGA-3'，R:5'-GATAGAGCATGACCCTGTAGGC-3')，產(chǎn)物1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.7 JC-10線粒體膜電位檢測試劑盒檢測SQW-76對U-2 OS細胞的影響 U-2 OS細胞接種24h后給SQW-76(終濃度4、6、8 μmol/L)和ADM、VP-16(終濃度6 μmol/L)，48 h收集細胞，JC-10染液37 ℃孵育30 min后用磷酸鹽緩沖液洗滌，通過TS100型倒置顯微鏡觀察及Olympus數(shù)碼相機照相，并用流式細胞儀檢測吸光度。

1.2.8 Caspase-3活性檢測試劑盒檢測SQW-76給藥后的活性：取對數(shù)生長期U-2 OS細胞接種于6孔板24 h后給藥SQW-76(終濃度4、6、8 μmol/L)和ADM、VP-16(終濃度6 μmol/L)，收集細胞后加入裂解液，冰浴裂解15 min，4 ℃ 16 000-20 000 g離心10～15 min，把上清轉(zhuǎn)移到冰浴預冷的離心管中，測定caspase 3的酶活性，待測樣本加Ac-DEVD-pNA(2 mM)，37 ℃孵育120 min，酶標儀測定A405。

1.3 統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 MTT法測SQW-76對U-2 OS的抗腫瘤活性 SQW-76對U-2 OS細胞的IC50值為(6.18±0.3)μmol/L，接近陽性藥VP-16(4.72±0.41)μmol/L和ADM(2.64±0.21)μmol/L。

2.2 SQW-76對U-2 OS細胞形態(tài)的影響 Hoechst33342是一種可以穿過細胞膜的細胞核染料，呈藍色熒光。PI能通過細胞膜受損的細胞進行細胞核染色，呈紅色熒光。Annexin V-FITC可與凋亡早期細胞膜結(jié)合，呈綠色熒光。因此，正常細胞Hoechst33342(+)/PI(-)/Annexin V-FITC(-)，凋亡早期細胞Hoechs/PI(-)/Annexin Hoechst33342(+)/PI(-)/Annexin V-FITC(+)，凋亡晚期細胞Hoechst33342(+)/PI(+)/AnnexinV-FITC(+)。通過Hoechst 33342、PI、Annexin V-FITC染色可以明顯觀測到U-2 OS細胞的凋亡情況。并且，隨著SQW-76濃度的增加，細胞凋亡程度更加明顯，見圖1。

組別U-2OS細胞凋亡抑制率(%)U-2OS+Caspase總抑制劑細胞凋亡抑制率(%)U-2OS+Caspase-3抑制劑細胞凋亡抑制率(%)SQW-76(4μmol/L)17.717.26a12.48SQW-76(6μmol/L)47.612.48b38.22aSQW-76(8μmol/L)71.4631.72b67.52

a為與U-2 OS組比較P<0.05，b為與U-2 OS組比較P<0.01

2.5 SQW-76對凋亡相關(guān)基因caspase-3、8、9 mRNA的影響 在發(fā)現(xiàn)Caspase總抑制劑可以抑制SQW-76的藥效后，檢測了了凋亡相關(guān)基因Caspase-3、8、9的基因表達。SQW-76作用于U-2 OS細胞24 h后，發(fā)現(xiàn)caspase-3、9的表達量有所增高，且隨著給藥濃度的提caspase-3、9的表達量也相應升高，Caspase-8表達量無明顯變化，見圖3、圖4。

2.7 檢測SQW-76給藥后Caspase-3活性 SQW-76給藥后U-2 OS細胞線粒體膜電位下降提示細胞凋亡與線粒體通路相關(guān)，所以檢測線粒體通路下游凋亡“執(zhí)行者”Caspase-3的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6 μmol/L時，Caspase-3活性升高。結(jié)果見表4。

表3 不同樣品JC-10染色后流式細胞儀吸光度平均值

a為與正常細胞比較P<0.05；b為與正常細胞比較P<0.01

正常細胞SQW-76M(6μmol/L)ADM(6μmol/L)VP-16(6μmol/L)Caspase-30.104±0.0030.158±0.006a0.06±0.005a0.121±0.003a

a為與正常細胞比較P<0.01

3 討論

SQW-76是以鬼臼毒素為基礎合成的一種新型化合物。本研究中，MTT實驗結(jié)果可見，SQW-76對U-2 OS細胞抑制作用明顯。給藥后48 h半數(shù)致死量IC50為6.18 μmol/L，與陽性對照藥ADM、VP-16較接近。

SQW-76給藥后U-2 OS細胞形態(tài)出現(xiàn)了明顯改變，本研究通過Hoechst33342/PI/Annexin V-FITC三染后觀察發(fā)現(xiàn)SQW-76作用于U-2 OS細胞后，細胞出現(xiàn)皺縮、變形、碎裂、胞漿濃縮、核固縮、出現(xiàn)凋亡小體。并且高濃度給藥后，PI高染、Annexin V高染細胞明顯增多，提示給藥后細胞增殖抑制作用明顯，并且可能與誘導細胞凋亡相關(guān)。流式細胞儀檢測低、中、高濃度SQW-76作用于U-2 OS細胞48 h后，凋亡細胞比例明顯增加，主要集中在凋亡晚期，隨給藥濃度的增加，凋亡細胞數(shù)目增加，說明SQW-76通過誘導凋亡抑制細胞增殖。

細胞凋亡途徑包括利用細胞表面死亡受體的外源性途徑和線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)內(nèi)源性途徑，即3條通路：死亡受體通路，線粒體通路，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路[3]。凋亡相關(guān)基因Caspase家族與這3條通路密切相關(guān)，Caspase-8與死亡受體通路相關(guān)，Caspase-9與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路、線粒體通路相關(guān)，3條通路均可誘導Caspase-3活性增高啟動細胞凋亡。通過MTT法發(fā)現(xiàn)，加入Caspase總抑制劑或Caspase-3抑制劑后，SQW-76對U-2 OS細胞的抑制率出現(xiàn)了改變，加入Caspase總抑制劑后細胞抑制率明顯下降，加入Caspase-3抑制劑后細胞抑制率輕微下降。提示SQW-76誘導U-2 OS細胞凋亡可能與Caspase家族相關(guān)，本研究運用RT-PCR法分析了不同濃度給藥后24 h細胞Caspase-3、Caspase8、Caspase9 mRNA的表達，結(jié)果顯示隨著給藥濃度的增加，Caspase-3、9的表達量也增高，而Caspase-8的表達量變化不明顯。這一結(jié)果提示SQW-76誘導細胞凋亡可能與Caspase-9相關(guān)的線粒體通路或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路相關(guān)，與Caspase-8相關(guān)的死亡受體通路可能無關(guān)。

細胞凋亡途徑中線粒體通路最早發(fā)生的事件是線粒體跨膜電位的破壞，我們使用JC-10細胞凋亡線粒體膜電位檢測試劑盒檢測不同濃度SQW-76對U-2 OS細胞給藥后24h細胞線粒體膜電位的改變。JC-10可以選擇性進入線粒體，在膜電位下降時，JC-10從橙綠色變?yōu)榫G色。熒光顯微鏡觀察時，正常細胞為高綠高紅，凋亡細胞為高綠低紅。用流式細胞儀分析時，紅色熒光通常通過FL-2通道來檢測，正常細胞(FL-1高，F(xiàn)L-2高)，凋亡細胞(FL-1高，F(xiàn)L-2低)。本研究發(fā)現(xiàn)，熒光顯微鏡可見正常U-2 OS細胞呈高綠高紅，不同濃度SQW-76給藥后，隨給藥濃度的增加，細胞逐漸變?yōu)楦呔G低紅表現(xiàn)，陽性藥ADM給藥后細胞變?yōu)楦呔G低紅，與文獻一致[4]。流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，隨給藥濃度的增高，F(xiàn)L-2吸光度降低。結(jié)果提示SQW-76給藥后，U-2 OS細胞線粒體膜電位隨給藥濃度升高而降低，SQW-76誘導細胞凋亡與線粒體通路相關(guān)。Caspase-3活性檢測結(jié)果顯示SQW-76濃度為6 μmol/L(IC50)時，Caspase-3活性顯著升高，與應用caspase-3抑制劑后細胞抑制率下降相符。

綜上所述，SQW-76在體外試驗抗骨肉瘤細胞作用明顯且體細胞毒性低于陽性藥物VP-16、ADM，其可能通過影響caspase-9、caspase-3相關(guān)基因誘導線粒體凋亡通路誘導U-2 OS細胞凋亡?？蓪QW-76進一步應用于抗骨肉瘤藥物的研究中，為研發(fā)新的抗腫瘤藥物提供實驗基礎。

[1] Zeze Fu,Biyong Deng,Yuxin Liao,et al.The anti-tumor effect of shikonin on steosarcoma by inducing RIP1 and RIP3 dependent necroptosis[J].BMC Cancer,2013,13:580-590.

[2] 馮欲靜，牛聰，曹波,等.鬼臼毒素衍生物NY-3誘導HeLa細胞凋亡及其機制探究[J].武警后勤學院學報(醫(yī)學版),2014,23(1):9-12,17.

[3] Dai C,Xiao X,Tang S，et al.Colistin-induced nephrotoxicity in mice involves the mitochondrial,death receptor,and endoplasmic reticulum pathways[J].Antimicrob Agents Chemother,2014,58(7):4075-4085.

[4] He M,Sun HG,Hao JY,et al.RNA interference-mediated FANCF silencing sensitizes OVCAR3 ovarian cancer cells to adriamycin through increased adriamycin-induced apoptosis dependent on JNK activation[J].Oncol Rep,2013,29(5):1721-1729.

Exploration on the induction of apoptosis on human osteosarcoma cells by podophyllotoxin derivate SQW-76 and its mechanism

WEI Xing1, WANG Chunjiang2, CAO Bo3, SUN Qiangwen3

(1.BaotouMedicalCollege,Baotou014040,China; 2.TheFourthHospitalofBaotou,Baotou014030,China; 3.TeachingandResearchSectionofPharmacognosyinDepartmentofRescueMedicine,LogisticsUniversityofPeople'sArmedPoliceForces,Tianjin300309,China)

Objective:To investigate the antitumor activity of podophyllotoxin derivatives SQW-76 on human osteosarcoma U-2 OS cells and its mechanism.Methods：The inhibition of U-2 OS cell and fibroblast cell proliferation and the growth curve of U-2 OS cells by SQW-76 and positive control drug etoposide (VP-16) and adriamycin (ADM) in vitro was determined by methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide(MTT)assay. Fluorescein isothiocyanate-propidium iodide (FITC-PI) double staining for apoptosis was measured by flow cytometry. Polymerase chain reaction (PCR)was determined to detect the effect of SQW-76 on expression of genes related to apoptosis in U-2 OS cells. The effect of caspase total inhibitor and caspase-3 inhibitor on SQW-76 induced apoptosis in U-2 OS cells was evaluated; the effects of SQW-76 on apoptosis of U-2 OS cell mitochondrial pathway by JC-10 mitochondrial membrane potential detection method were measured; Caspase-3 protein activity was detected.Results：SQW-76 inhibited the proliferation of U-2 OS cells in vitro significantly. The value of IC50 was (6.18 + 0.3) mol/L. SQW-76 inhibited U-2 OS cells through apoptosis, which was detected by flow cytometry; SQW-76 was found to upregulate the expression of Caspase-3, 9 mRNA by PCR; Caspase total inhibitor and Caspase-3 inhibitor could inhibit U-2 OS cell apoptosis induced by SQW-76; The mitochondrial membrane potential of U-2 OS reduced after SQW-76 treatment; Caspase-3 protein activity increased after SQW-76 treatment. Conclusion：SQW-76 can inhibit osteosarcoma cells in vitro significantly. The toxicity somatic cell of SQW-76 is lower than the positive drug VP-16 and ADM, which may influence the caspase-9 and caspase-3 gene through mitochondrial apoptosis pathway induced apoptosis in U-2 OS cells.

Podophyllotoxin derivatives; Osteosarcoma; U-2 OS cells; Apoptosis; Antitumor

國家自然科學基金資助項目(30873363)

王春江，曹 波

2015-08-26)