劉晉津佘靜偉吳 騰郝志明

（1.天津市南開醫(yī)院實驗動物室，天津 300100；2.天津市西青區(qū)畜牧水產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，天津 300380；3.天津農(nóng)學(xué)院，天津 300384）

溫度對犬精液冷凍保存的研究

劉晉津1佘靜偉2吳 騰1郝志明3*

（1.天津市南開醫(yī)院實驗動物室，天津 300100；2.天津市西青區(qū)畜牧水產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，天津 300380；3.天津農(nóng)學(xué)院，天津 300384）

本實驗在以往研究的基礎(chǔ)上進一步研究了冷凍起始溫度（始凍溫度）、解凍溫度對精子活率的影響.實驗結(jié)果表明:始凍溫度為-70℃時凍后精液質(zhì)量最好，凍后鏡子活率達0.6284±0.0408，優(yōu)于-65℃和-75℃時的凍后精子活率；解凍溫度為70℃時對解凍后精液質(zhì)量最好，達0.6810±0.0324，明顯優(yōu)于60℃和65℃的精子活率。

冷凍；精子；始凍溫度；解凍溫度

由于畜牧業(yè)的發(fā)展需要，牛的凍精在市場上比較常見。隨著生物技術(shù)、動物學(xué)、繁殖學(xué)的不斷發(fā)展，尤其是體外受精技術(shù)的不斷完善使犬精液的冷凍保存越來越受到關(guān)注。犬作為人類最親密的朋友，為人類的科研發(fā)展以及寵物飼養(yǎng)做出了巨大的貢獻，犬精液的冷凍保存在選種、基因改良、遺傳病研究，提高公犬利用率等諸多方面都有獨特的優(yōu)勢。

1780年，意大利生理學(xué)家SpMlanzani第一次進行了犬的人工授精實驗。此后，Seager，Olar TT、Yu I、Cardoso RDS等人在這方面做了諸多工作。美國早在二十世紀(jì)七十年代就投入了大量精力研究犬精液的冷凍保存。

相較于國外，國內(nèi)研究起步相對較晚，目前并沒有形成一套成熟的方法。張志光、郝志明、潘壽文等人對影響犬精液冷凍保存的諸多因素做了研究，取得了一定的進展。

本實驗在以往的經(jīng)驗基礎(chǔ)上，以Tris-葡糖糖為稀釋液，液氮面上2cm處熏蒸，對始凍溫度和解凍溫度進行更為細化的研究，以便找到更為合適的犬精液保存方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性大丹犬，3歲，身體健康，精液品質(zhì)良好。

1.2 實驗器械和試劑

1.2.1 實驗器械

離心機：型號DT5-1，北京時代北利離心機有限公司；

顯微鏡：型號36XL，上光精密光學(xué)檢測儀器銷售有限公司；電子天平：型號T500，常熟市雙杰測試儀器廠；集精杯：玻璃漏斗插入量筒，以棉塞封口制成；

1.2.2 稀釋液

用雙蒸水配置基礎(chǔ)稀釋液（Tris3%，檸檬酸1.9%，葡萄糖1.5%）。用等體積的75%的基礎(chǔ)稀釋液加入25%的卵黃配置成稀釋一液，再將等體積的85%稀釋一液加入15%的甘油，配置成稀釋二液。

1.3 實驗方法

1.3.1 人工按摩采精

綁定實驗犬，手握法采集精液。我們將射精分為三段，第一段為剛剛射精階段，第二部分為射精中段，第三部分為射精尾段（射精即將結(jié)束），采精時注意收集精液的中間部分，觀察精液色澤、氣味，顯微鏡下估算精子活率。

1.3.2 鮮精處理及保存

調(diào)試離心機，使剛剛采集的鮮精在2000rpm下離心5分鐘。棄掉上清液，向管中加入等溫的稀釋一液并混勻，封口。放入盛有500ml，30℃熱水的燒杯中，將燒杯放入4℃冰箱保存。18個小時后，將已預(yù)冷至4℃等體積的稀釋二液緩慢加入精液中，混勻后再次放回4℃冰箱保存4h。

1.3.3 冷凍前準(zhǔn)備

（1）測量液氮面高度：將液氮罐提桶試探性插入罐內(nèi)，當(dāng)聽到斯拉聲時，停止插入，用刻度尺量出插入的深度，此深度即為液氮面高度。

（2）精液裝管：將精液吸入細管，使精液距細管口大約為1.0cm，封口。

1.3.4 冷凍

將裝有精液的細管插入已預(yù)冷至-65℃、-70℃、-75℃的細管插座內(nèi)，立即放入液氮罐內(nèi)液面上方2cm處進行熏蒸，10min后，取出細管，立即投入液氮內(nèi)。

1.3.5 解凍和凍后精子活率的檢查

從液氮罐中取出細管，放入65℃的水中解凍5s。在400倍鏡下測定精子活率。

1.4 統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)按單因子試驗進行統(tǒng)計分析，并進行顯著性檢驗。

2 實驗結(jié)果

2.1 始凍溫度對凍后精子活率的影響從表 1 可以看出，凍后精子活率隨始凍溫度的不同而變化。始凍溫度為-70℃時凍后精子的活率顯著高于始凍溫度為-65℃和-75℃時的活率（P〈0.05），為0.6284±0.0408。但始凍溫度為-65℃時和-75℃時的活率間則沒有明顯的差異（P＞0.05）。

表1 始凍溫度對凍后精子活率的影響

2.2 解凍溫度對凍后精子活率的影響

表2 解凍溫度對凍后精子活率的影響

從表1的研究結(jié)果看-70℃的始凍溫度效果最好。我們將-70℃設(shè)為始凍溫度來研究解凍溫度。從表2可以看出，精子的活率隨解凍溫度的升高而提高。解凍溫度為65℃和70℃時凍后精子活率為0.6110±0.0742和0.6810±0.0324，極顯著高于解凍溫度為60℃時的活率（P〈0.01）。解凍溫度為70℃時的凍后精子活率顯著高于解凍溫度為65℃時的活率（P〈0.05），為0.6810±0.0324。

3 討論

3.1 精液采集

采精環(huán)節(jié)是本實驗的基礎(chǔ)。采精方法有很多種，例如假陰道法、按摩采精法、電刺激法等等。相較于其他方法，人工按摩采精法簡單可靠，只要實驗人員細心，就可以很好的將射精的三個階段分開，收集精液最為良好的部分。

3.2 始凍溫度的探討

當(dāng)精液的溫度由0℃緩慢降到-60℃時，精液中的水分由液態(tài)變?yōu)楣虘B(tài)，對精細胞的細胞器造成巨大的破壞。因此，研究人員的實驗經(jīng)驗表明0℃--60℃是精子的破壞區(qū)域。但是，在保護劑的參與下，精液溫度快速降到-60℃以下，固態(tài)精液呈現(xiàn)玻璃態(tài)，不會對細胞器造成破壞。潘壽文等人在二十世紀(jì)八十年代就對犬精液低溫保存進行過研究，結(jié)果表明-80℃時效果最為理想（0.4500±0.0447），郝志明等人研究發(fā)現(xiàn)-113℃則精子死亡率上升（0.1250±0.0612）。本實驗在以往的基礎(chǔ)上進一步研究，發(fā)現(xiàn)始凍溫度為-70℃時效果更為理想，為0.6284±0.0408。而-75℃時則精子活率降低。綜合來看，溫度的變化（-65℃、-70℃、-75℃、-80℃、-113℃）并沒有一條理想的曲線表明精子的活率是隨著溫度曲線的變化而有規(guī)律的升高或者降低。其中的規(guī)律還需要進一步研究。

3.3 解凍溫度的探討

研究表明，精子在低溫狀態(tài)下代謝幾乎停止，使其能夠保存。一旦升溫，精子又能復(fù)蘇。Olar TT等人對解凍溫度做過系統(tǒng)的研究，結(jié)果表明高溫快速解凍效果更好。熊前等人研究發(fā)現(xiàn)采用高溫水浴快速解凍方法，犬精子的活力最佳。郝志明等人研究發(fā)現(xiàn)65℃解凍5s效果理想，本實驗研究發(fā)現(xiàn)70℃解凍5s要比65℃更好，為0.6810±0.0324?？梢姼邷乜焖俳鈨龈m于精子的成活。那么快速的使精子通過不適宜生存的低溫區(qū)是實驗成功的關(guān)鍵。市場上牛的體外受精比較常見，原因在于牛凍精的成活率高，市場比較成熟。本實驗表明始凍溫度為-70℃，解凍溫度70℃時，精子成活率在0.6810±0.0324，在配套設(shè)施完善的條件下完全有理由應(yīng)用于實際生產(chǎn)。

［1］ Seager SJW. Successful pregnancies utilizing frozen dog Semen［J］. A. I. Digest，1969，（17）：6-16.

［2］ Olar TT，Bowen RA and Pickett BW.Influence of extender，cryopreservative and seminal processing procedures on postthaw motility of canine spermatozoa frozen in straws［J］.Theriogenology，1989，31（2）：451-461.

［3］ Cardoso RDS et al Cryopreservation of canine semen using a coconut water extender with eggyolk and three different glycerolconcentrations［J］.Therio-genology，2003，59（3-4）：743-751.

［4］ 張志光，劉清神，劉運忠.不同稀釋液對Beagle犬精液保存效果的比較［J］.廣東畜牧獸醫(yī)科技，2013，（6）：37-40.

［5］ 郝志明，王偉峰，潘敏.犬精液低溫保存稀釋液的研究［J］.甘肅畜牧獸醫(yī)，2005，（6）：16-19.

［6］ 潘壽文，劉湖，馬大君.犬的精液冷凍技術(shù)［J］.畜牧與獸醫(yī)，1986，（3）：105-106.

［7］ 熊前，葉俊華，吳衍，等.犬精液冷凍與解凍方法的研究報告［J］.當(dāng)代畜牧，2008，（4）：39-40.

［8］ 郝志明，姚金宇，王章龍，等.犬精液冷凍解凍技術(shù)研究［J］.甘肅畜牧獸醫(yī)，2005，35（5）：9-12.

劉晉津（1984—），男，助理獸醫(yī)師，主要從事實驗動物中心的管理、動物實驗、畜牧獸醫(yī)后勤保障，遺傳育種研究等。

郝志明（1963—），男，教授，工作于天津農(nóng)學(xué)院，研究方向為動物生殖生理和生殖技術(shù)。