李正偉，許益娟，張若鵬

（1.大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，云南大理671000；2.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南大理671000）

激光輔助孵化對(duì)高齡婦女的凍融胚胎種植潛力的影響

李正偉1，許益娟1，張若鵬2*

（1.大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，云南大理671000；2.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南大理671000）

目的∶分析激光輔助孵化技術(shù)對(duì)高齡婦女凍融胚胎種植潛力的影響。方法：對(duì)427例患者，根據(jù)年齡、是否輔助孵化進(jìn)行分組，比較各組間胚胎種植率及臨床妊娠率。結(jié)果：＜35歲的患者，兩組胚胎種植率AH組高于非AH組、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，臨床妊娠率無(wú)明顯差異、差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而≥35歲的患者，胚胎種植率及臨床妊娠率AH組高于非AH組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：激光輔助孵化技術(shù)的應(yīng)用能夠提升高齡患者的臨床妊娠率，尤其是能顯著提高凍融胚胎移植的種植率。

激光輔助孵化；高齡婦女；凍融胚胎；移植；種植率；臨床妊娠率

［DOI］10.3969/j.issn.2096-2266.2016.10.015

輔助孵化（assisted hatching，AH）應(yīng)用于人類(lèi)輔助生殖技術(shù)已經(jīng)有將近二十余年的歷史，這項(xiàng)技術(shù)最早在1991由Jacques Cohen提出并應(yīng)用，它利用物理或化學(xué)的方法對(duì)胚胎的透明帶進(jìn)行削薄、打孔甚至去除部分透明帶，從而有利于胚胎從透明帶內(nèi)“破殼”而出，或使透明帶溶解消失，通過(guò)對(duì)透明帶的這種處理實(shí)現(xiàn)輔助胚胎孵化、促進(jìn)胚胎植入的目的，增加胚胎著床的成功率，目前主要應(yīng)用的方法有以下幾種∶激光法、機(jī)械切割法及酸化法等。近年來(lái)隨著顯微激光醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，激光系統(tǒng)因其快速、準(zhǔn)確、安全等優(yōu)越性被引入輔助孵化技術(shù)，從而形成了激光輔助孵化技術(shù)，并在臨床應(yīng)用中取得了顯著的效果〔1〕。輔助孵化〔2〕主要適用于39歲以上或基礎(chǔ)卵泡刺激素（Follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）升高（FSH＞10 U/L）者或透明帶較厚（≥15 μm）或透明帶顏色異常以及多次（≥3次）行體外授精-胚胎移植治療將形態(tài)發(fā)育正常的胚胎移植但著床失敗的女性不孕患者。其次，凍融胚胎的移植（frozen-thawed embryo transfer，F(xiàn)ET）或胚胎發(fā)育速度/形態(tài)異常，胚胎發(fā)育與同期對(duì)照組變慢或形態(tài)不規(guī)則等也建議應(yīng)用輔助孵化〔3〕。高齡婦女的卵母細(xì)胞往往具有透明帶過(guò)厚（≥15 μm）或過(guò)硬的特點(diǎn)，所以對(duì)于高齡婦女利用輔助孵化技術(shù)可有利于囊胚孵化，提高妊娠率。我們對(duì)生殖醫(yī)學(xué)科高齡婦女體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）427個(gè)周期進(jìn)行了回顧性分析，旨在分析激光輔助孵化技術(shù)對(duì)高齡婦女凍融胚胎種植潛力的影響。

1　對(duì)象與方法

1.1對(duì)象以2013年3月至2015年3月在大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科行IVF-ET包括卵母細(xì)胞漿內(nèi)單精子注射（Intracytoplasmic sperm injection，ICSI）治療的患者為研究對(duì)象，其中女方年齡≥35歲的129個(gè)周期。經(jīng)夫婦雙方均同意行激光輔助孵化后移植207個(gè)周期（激光組），其余220個(gè)周期行常規(guī)胚胎移植（常規(guī)組）。

1.2方法

1.2.1超促排方案IVF/ICSI均采用我院生殖科常規(guī)超促排方案，肌肉注射大絨毛膜促性腺激素（Human Chorionic Gonadotropin，HCG）36 h后取卵。

1.2.2受精與培養(yǎng)以18～20 h后觀察到雙原核為正常受精作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行胚胎移植。根據(jù)觀察第3天胚胎中卵裂球數(shù)目、碎片所占比例以及卵裂球的均勻程度將胚胎進(jìn)行分級(jí)，只給予移植1～3級(jí)的胚胎，其中1、2級(jí)胚胎稱為優(yōu)質(zhì)胚胎，1、2、3級(jí)胚胎稱為可用胚胎。

1.2.3輔助孵化采用1.48 μm非接觸式激光（SATURN3激光破膜儀，英國(guó)）對(duì)激光組進(jìn)行胚胎透明帶薄化。將胚胎置于40倍倒置顯微鏡（OLYMPUS IX70，英國(guó)）下，選擇卵周隙相對(duì)較大或碎片集中區(qū)，調(diào)整激光靶心，使其位于該區(qū)透明帶外緣，根據(jù)透明帶厚度改變激光照射時(shí)間，從而調(diào)整透明帶上的孔徑大小，通常照射時(shí)間為6～16 ms，一般不超過(guò)20 ms，每個(gè)胚胎連續(xù)照射不超過(guò)10次，否則易造成胚胎受損，從而影響胚胎著床，我科采用在胚胎的3個(gè)面激光削薄，最終在透明帶上形成一個(gè)長(zhǎng)約80 μm（約相當(dāng)于透明帶總長(zhǎng)度的1/4左右），深度為透明帶總厚度的50%～80%的薄化區(qū)，將輔助孵化后的胚胎放入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)至移植。

1.2.4內(nèi)膜準(zhǔn)備自然周期∶根據(jù)陰道超聲（Tran svaginal ultrasound，TVS）檢測(cè)，優(yōu)勢(shì)卵泡直徑≥14 mm而≤18 mm，子宮內(nèi)膜厚度達(dá)到7～8 mm以上，排卵即黃體生成素（Luteinizing Hormore，LH）峰（當(dāng)血LH＞20 U/L時(shí)可認(rèn)為出現(xiàn)血LH峰）后第2～3天為解凍日。激素替代周期∶分為遞增方案及恒定劑量方案，月經(jīng)第3～5天開(kāi)始用戊酸雌二醇片（補(bǔ)佳樂(lè)，國(guó)產(chǎn)），內(nèi)膜厚度達(dá)到8 mm或以上，用3 d地屈孕酮后，于第4～5天進(jìn)行胚胎移植。

1.2.5胚胎移植與妊娠結(jié)果判斷移植后14 d進(jìn)行血或尿HCG或β-亞基-人線毛膜促性腺激素（β-Human Chorionic Gonadotropin，β-HCG）測(cè)定，如為陽(yáng)性，移植后30～35 d行超聲檢查示子宮腔內(nèi)見(jiàn)妊娠囊及原始心管搏動(dòng)即可確定為胚胎種植成功，即臨床妊娠。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究采用SPSS17.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，設(shè)定P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1激光組胚胎種植率與臨床妊娠率激光組中移植207個(gè)周期，臨床妊娠61例，妊娠率為29.46%，其中雙胎17例。共移植胚胎394個(gè)，胚胎種植117個(gè)，胚胎種植率為29.70%。

2.2常規(guī)組胚胎種植率與臨床妊娠率常規(guī)組中移植220個(gè)周期，臨床妊娠54例，妊娠率為24.55%，其中雙胎13例。共移植胚胎424個(gè)，胚胎種植74個(gè)，胚胎種植率為17.45%。

2.3高齡婦女與非高齡婦女中輔助孵化組與非輔助孵化組間妊娠率的比較在＜35歲婦女中，比較AH組與非AH組臨床妊娠率，其中AH組臨床妊娠率為27.97%，略高于對(duì)照組27.74%（P＞0.05），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在≥35歲婦女中，AH組臨床妊娠率為32.81%，明顯高于對(duì)照組16.92%（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。激光輔助孵化能夠有效提升高齡患者的臨床妊娠率。見(jiàn)表1。

表1　高齡婦女與非高齡婦女中輔助孵化組與非輔助孵化組間妊娠率的比較

2.4高齡婦女與非高齡婦女中輔助孵化組與非輔助孵化組間種植率的比較在＜35歲婦女中，比較AH組與非AH組胚胎種植率，其中AH組胚胎種植率為25.14%，明顯高于對(duì)照組19.68%（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在≥35歲婦女中，AH組臨床妊娠率為17.65%，明顯高于對(duì)照組6.91%（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。激光輔助孵化均能提高兩組人群的胚胎種植率，其中對(duì)高齡組人群提高胚胎種植率更顯著。見(jiàn)表2。

表2　高齡婦女與非高齡婦女中輔助孵化組與非輔助孵化組間胚胎種植率的比較

2.5高齡婦女與非高齡婦女中輔助孵化組與非輔助孵化組間流產(chǎn)率的比較在＜35歲婦女中，比較AH組與非AH組臨床妊娠率，其中AH組臨床流產(chǎn)率為70.63%，略高于對(duì)照組67.74%（P＞0.05），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在≥35歲婦女中，AH組臨床妊娠率為67.19%，略高于對(duì)照組64.62%（P＞0.05），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。激光輔助孵化技術(shù)對(duì)胚胎的損傷并不影響臨床流產(chǎn)率。見(jiàn)表3。

表3　高齡婦女與非高齡婦女中輔助孵化組與非輔助孵化組間胚胎種植率的比較

3　討論

隨著現(xiàn)代科技的不斷發(fā)展與進(jìn)步，人類(lèi)輔助生殖技術(shù)得到了創(chuàng)新性的發(fā)展，為那些不孕不育患者帶來(lái)了更多的生育機(jī)會(huì)，是廣大因各種原因而不能生育的夫婦的福音。但是，目前胚胎移植后的種植率仍較低，這是我們輔助生殖領(lǐng)域一個(gè)需要解決且很棘手的重要問(wèn)題。大量研究表明，在行胚胎移植前用胚胎移植管輕微搔刮子宮內(nèi)膜，可以有效提高妊娠率〔4〕。有些研究者質(zhì)疑輔助孵化的安全性，而Zhou H等〔5〕的研究通過(guò)比較產(chǎn)科及新生兒科AH組與非AH組的產(chǎn)科結(jié)局、新生兒的結(jié)果和先天性出生缺陷的記錄證實(shí)了輔助孵化技術(shù)的安全性。透明帶對(duì)溫度的適應(yīng)度較差，當(dāng)透明帶暴露于極低的溫度后，透明帶會(huì)發(fā)生凍結(jié)反應(yīng)，導(dǎo)致透明帶變硬，從而導(dǎo)致胚胎孵化困難，目前多項(xiàng)研究認(rèn)為這是造成胚胎移植后種植率較低的主要原因。卵細(xì)胞的外層具有外被，其主要成分為糖蛋白，在哺乳動(dòng)物中該外被稱為透明帶，而人類(lèi)胚胎透明帶有內(nèi)外兩層，其中內(nèi)層富有彈性，卻難以薄化和擴(kuò)張，這是造成胚胎不易成功孵化的主要原因〔6〕。大量的研究表明，對(duì)透明帶削薄的最適宜范圍是∶深度達(dá)胚胎透明帶的致密層，即相當(dāng)于透明帶厚度的50%～80%，寬度則相當(dāng)于透明帶總長(zhǎng)的1/4〔7〕。本次研究中使用的激光照射也采用了以上提到的薄化范圍，且為了更好地避免激光帶來(lái)的熱效應(yīng)和突變效應(yīng)，我院采用三邊法照射，并不局限于采用連續(xù)照射，且我院采用的激光能量也是參考了Schimmel T等的研究〔8〕，我們利用激光處理透明帶時(shí)選擇卵周隙相對(duì)較大或碎片相對(duì)集中區(qū)進(jìn)行薄化，經(jīng)觀察研究，該方法能有效減少激光照射透明帶時(shí)對(duì)胚胎造成的損傷，故兩個(gè)年齡組的流產(chǎn)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

目前，對(duì)于不同輔助孵化對(duì)胚胎種植潛力的影響仍存在爭(zhēng)議，Balaban等〔9〕對(duì)透明帶切割法（PZD）、酸化法、酶化法和激光法4種輔助孵化方法對(duì)臨床妊娠率及胚胎種植率的影響進(jìn)行了對(duì)比性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種方法對(duì)胚胎種植潛力的影響幾乎相似，而其中各種方法的利弊又決定了激光輔助孵化法是目前應(yīng)用最為廣泛的。敖磊等〔10〕的研究中認(rèn)為，激光輔助孵化法中，薄化與打孔兩種透明帶處理方式在凍融胚胎移植中的臨床妊娠率及胚胎種植率相近，而激光薄化法能有效減少激光處理透明帶時(shí)所帶來(lái)的熱效應(yīng)對(duì)胚胎造成的損傷，所以認(rèn)為激光削薄比激光打孔更適用于臨床應(yīng)用，現(xiàn)在也逐步被廣泛應(yīng)用。而Wan CY等〔11〕的研究中通過(guò)比較激光輔助孵化組與對(duì)照組的移植率與臨床妊娠率及活產(chǎn)率，初步評(píng)估了激光輔助孵化對(duì)胚胎移植的影響。而在我們的研究中，除了與年齡相關(guān)的影響因素，兩組患者其他各影響因素之間均無(wú)明顯差異，例如胚胎質(zhì)量的篩選、進(jìn)行胚胎移植的時(shí)機(jī)及進(jìn)行胚胎移植的內(nèi)膜準(zhǔn)備等因素。從本次研究得出數(shù)據(jù)可知，在非高齡產(chǎn)婦群體中采用激光輔助孵化組與常規(guī)組的臨床妊娠率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而在高齡產(chǎn)婦中，采用激光輔助孵化與常規(guī)組的臨床妊娠率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且激光組的胚胎種植率要顯著高于常規(guī)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。通過(guò)對(duì)比高齡婦女組中AH組與非AH組間的種植率和妊娠率，可得出高齡婦女中AH組的種植率及妊娠率均顯著高于非AH組（P＜0.05）。故認(rèn)為激光輔助孵化技術(shù)能顯著提高胚胎種植率，提升凍融胚胎的種植潛力。這與張琪瑤等〔12〕及Lee YS等〔13〕的研究結(jié)果相似。

綜上所述，激光輔助孵化技術(shù)的應(yīng)用能夠提升高齡患者的臨床妊娠率，尤其是能顯著提高凍融胚胎移植的種植率。

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Influence of Laser-assisted Hatching on the Potential of Elderly Women's Frozen-thawed Embryo Implantation

Li Zhengwei1，Xu Yijuan1，Zhang Ruopeng2*
（1.Clinical College，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China；2.The First Affiliated Hospital of Dali University，Dali，Yunnan 671000，China）

Objective:To analyze the influence of laser-assisted hatching technology on the potential of elderly women's freezethawed embryo transfer.Methods:427 patients were grouped by age and assisted hatching（AH）.Comparison of embryos implantation rate and clinical pregnancy rate were carried out among groups.Results:Among＜35 years old patients，two groups'embryos implantation rate of AH were higher than non-AH groups with statistically significant，but there was no difference in clinical pregnancy rate and statistic；among≥35 years old patients，embryo implantation rate and clinical pregnancy rate of AH group were higher than non-AH group，and were statically significant.Conclusion:The application of laser-assisted hatching technology can increase clinical pregnancy rate in elderly patients，especially in greatly promoting implantation rate of frozen-thawed embryo.

laser-assisted hatching；elderly women；frozen-thawed embryo；transplant；implantation rate；clinical pregnancy rate

R321.1

B

2096-2266（2016）10-0057-04

（責(zé)任編輯董杰）

云南省教育廳科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目（2013C172）

2015-08-18

2016-04-29

李正偉，碩士研究生，主要從事婦產(chǎn)科學(xué)生殖醫(yī)學(xué)研究.

*通信作者：張若鵬，副主任醫(yī)師.