楊勇琴，楊澤芳，陳亞麗，歐陽(yáng)文軍，楊佳妮，張曉娟，熊　偉*

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理671000；2.云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理671000；3.大理大學(xué)大理教學(xué)醫(yī)院呼吸內(nèi)科，云南大理671000）

大理白族老年人2型糖尿病與線粒體ND1基因T3394C突變的相關(guān)性

楊勇琴1，2，楊澤芳1，陳亞麗1，歐陽(yáng)文軍1，楊佳妮1，張曉娟3，熊偉1，2*

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理671000；2.云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理671000；3.大理大學(xué)大理教學(xué)醫(yī)院呼吸內(nèi)科，云南大理671000）

目的：研究人線粒體呼吸鏈煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）脫氫酶第一亞單位（ND1）基因3394位點(diǎn)T→C突變與我國(guó)云南大理白族老年人2型糖尿病的相關(guān)性。方法：隨機(jī)抽取無(wú)血緣關(guān)系的云南大理白族200例老年2型糖尿病患者（糖尿病組）及218例無(wú)糖尿病家族史、糖耐量正常的老年人群（正常對(duì)照組），用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增、限制性內(nèi)切酶HaeⅢ消化進(jìn)行點(diǎn)突變篩查。結(jié)果：糖尿病組中5例患者存在線粒體DNA ND1基因3394位點(diǎn)T→C突變（2.50%），正常對(duì)照組中僅有1例出現(xiàn)該位點(diǎn)突變（0.46%），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。線粒體ND1基因3394位點(diǎn)T→C基因突變的糖尿病患者具有明顯的母系遺傳特征。結(jié)論：線粒體ND1基因3394位點(diǎn)T→C突變與云南省大理白族老年人2型糖尿病患者發(fā)病相關(guān)。

線粒體ND1基因；2型糖尿??；T3394C突變；白族

［DOI］10.3969/j.issn.2096-2266.2016.10.008

人線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）為16 569 bp的環(huán)狀雙鏈DNA分子，共編碼37個(gè)基因，包括13個(gè)呼吸鏈復(fù)合體亞單位的基因、2個(gè)rRNA基因（12S rRNA和16S rRNA）和22個(gè)tRNA基因，具有母系遺傳的特征。tRNALeu（UUR）基因?yàn)榫€粒體糖尿病的“突變熱點(diǎn)”，尤其以A3243G位點(diǎn)突變最為多見(jiàn)，1997年美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)已將這類糖尿病分型為胰島β細(xì)胞功能遺傳缺陷性糖尿病〔1〕。

線粒體被稱為細(xì)胞的“動(dòng)力工廠”，是細(xì)胞內(nèi)通過(guò)氧化磷酸化合成ATP的主要場(chǎng)所。編碼線粒體煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）脫氫酶第一亞基（ND1）的基因突變可能導(dǎo)致線粒體呼吸鏈復(fù)合體I酶活性降低，細(xì)胞內(nèi)ATP合成減少，進(jìn)而影響胰島β細(xì)胞合成和分泌胰島素，促進(jìn)糖尿病的發(fā)生〔2〕。2型糖尿?。═ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是臨床最常見(jiàn)的糖尿病類型，門(mén)診的糖尿病人中，90%以上都屬于2型糖尿病，多發(fā)于肥胖的中老年人。國(guó)內(nèi)外研究表明，不同種族和不同地區(qū)的人群中，線粒體基因組許多不同位點(diǎn)的基因點(diǎn)突變均可能與老年人2型糖尿病的發(fā)生有關(guān)〔3-6〕。目前，線粒體DNA的ND1基因T3394C點(diǎn)突變是否與我國(guó)白族老年人群2型糖尿病的發(fā)生相關(guān)尚無(wú)報(bào)道。基因多態(tài)性有顯著的種族差異，在環(huán)境-基因相互作用模式上，不同的種族之間有可能有較大差異。因此，本研究利用大理地區(qū)特有的資源優(yōu)勢(shì)，開(kāi)展云南大理地區(qū)白族老年人群2型糖尿病的發(fā)生與線粒體ND1基因T3394C點(diǎn)突變相關(guān)性的研究工作，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1研究對(duì)象選取2014年1月至2015年9月在大理市第一人民醫(yī)院和云南省第四人民醫(yī)院就診的200例大理本地白族老年糖尿病患者作為糖尿病組，男83例，女117例。年齡60～81歲，平均年齡（66.7±8.4）歲。對(duì)照組選取218例，男102例，女116例，年齡60～85歲，平均年齡（67.4±7.9）歲，糖耐量正常且無(wú)糖尿病家族史，無(wú)急性心腦血管疾病、急性應(yīng)激狀況及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病。兩組患者性別、年齡及體重指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。以上研究個(gè)體之間無(wú)血緣關(guān)系，追溯3代均為同一民族個(gè)體，且在云南大理地區(qū)居住3代以上。所有的檢查以及標(biāo)本的收集手續(xù)和過(guò)程均按照赫爾辛基宣言要求的原則進(jìn)行，并獲大理大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，嚴(yán)格按照其規(guī)定的程序進(jìn)行，同時(shí)得到患者的知情同意〔7〕。常規(guī)抽取外周靜脈血，進(jìn)行基因組DNA提取。

1.2儀器及試劑

1.2.1儀器2720 Thermal Cycler型號(hào)PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）；凝膠成像儀（美國(guó)BIO-RAD公司）；DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）；生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；全自動(dòng)滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；DYCZ-24D蛋白電泳槽（北京六一儀器廠）；HH-4恒溫水浴鍋（上海國(guó)華電器有限公司）；微量移液器（德國(guó)Eppendorf公司）。

1.2.2試劑哺乳動(dòng)物全血基因組DNA提取試劑盒（北京天根生物科技公司）；限制性核酸內(nèi)切酶HaeⅢ（美國(guó)NEB公司）；Taq DNA聚合酶（大連Takara公司）；DNA Marker（90602C）（四川綿陽(yáng)天恩澤基因工程有限公司）；DuRed核酸染料（北京全式金公司）；瓊脂糖（Biowest Agarose）為西班牙進(jìn)口分裝；乙醇、異丙醇等化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3方法

1.3.1引物設(shè)計(jì)及合成引物設(shè)計(jì)參照人mtDNA劍橋序列（GenBank∶J01415），由昆明碩擎生物技術(shù)有限公司合成（PAGE級(jí)純化，純度99%）。上游引物（Forword）序列為5'-GGATCAGGACATCCCGAT-3'，下游引物（Reverse）序列為5'-GGTTTTAGGGG CTCTTTGG-3'。

1.3.2基因組DNA提取取外周靜脈血2 mL，加入0.2 mL EDTA-K2抗凝。采用哺乳動(dòng)物全血基因組DNA提取試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)提取外周血總DNA，NanoDrop核酸蛋白分析儀測(cè)定DNA濃度和純度。

1.3.3聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增-限制性酶切片段多態(tài)性分析（PCR-RFLP）PCR反應(yīng)體系為∶DNA模板（50 ng/μL）1 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，上游引物和下游引物各1 μL，加雙蒸水補(bǔ)充至總體積25 μL。PCR反應(yīng)條件為∶95℃預(yù)變性5 min后進(jìn)入循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸50 s，共循環(huán)35次，最后72℃延伸5 min，4℃保存。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物10 μL加至2 μL的6×loading buffer中混勻，加樣于1.5%瓊脂糖凝膠，恒壓120 V，于1×TAE緩沖液中電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察有無(wú)PCR產(chǎn)物。HaeⅢ限制性內(nèi)切酶于37℃恒溫水浴中酶切PCR產(chǎn)物30 min，15%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳酶切產(chǎn)物，DuRed核酸染料染色，凝膠成像系統(tǒng)顯影觀察。

1.3.4DNA測(cè)序?qū)?例疑似突變陽(yáng)性的T2DM組標(biāo)本及8例無(wú)突變的正常對(duì)照組標(biāo)本的PCR產(chǎn)物送昆明碩擎生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA純化和測(cè)序。

1.3.5T2DM組患者臨床資料收集記錄T2DM組和正常對(duì)照組個(gè)體的性別、年齡、起病年齡、家族史、體重指數(shù)（BMI）、空腹血糖（FBG）、餐后2 h血糖（P2BG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、血清C肽（F-C peptide）及治療方法（飲食、口服降糖藥或胰島素治療）〔8〕。

2　結(jié)果

2.1線粒體DNA片段的PCR擴(kuò)增利用合成的引物分別對(duì)T2DM組和正常對(duì)照組樣本的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)期目的片段大小為266 bp，1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增效果良好，與預(yù)期片段大小相符，沒(méi)有非特異性條帶的出現(xiàn)。見(jiàn)圖1。

圖1　mtDNA ND1基因片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2PCR-RFLP檢測(cè)線粒體tRNALeu（UUR）基因T3394C突變∶通過(guò)PCR-RFLP分析（HaeⅢ/3394），野生型經(jīng)HaeⅢ內(nèi)切酶水解，可以得到169、97 bp兩個(gè)酶切片段，當(dāng)3394發(fā)生T→C突變后（酪氨酸→組氨酸），新增的酶切位點(diǎn)將97 bp切割為80、17 bp兩個(gè)片段，因此T3394C突變個(gè)體最終可得到169、80、17三個(gè)片段。配制15%的聚丙烯酰胺凝膠，120 V穩(wěn)壓電泳約2 h，電泳結(jié)束后核酸染料染色，于凝膠成像系統(tǒng)拍照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明∶200例T2DM組患者中共檢出5例T3394C突變，其中3例為線粒體DNA異質(zhì)性突變，2例為線粒體DNA同質(zhì)性突變。218例正常對(duì)照組中有1例T3394C突變，為線粒體DNA異質(zhì)性突變。見(jiàn)圖2。

圖2　非變性PAGE電泳檢測(cè)線粒體ND1基因T3394C突變

2.3線粒體DNA T3394C突變分析在200例T2DM組患者中共檢出5例T3394C突變，突變率為2.50%，218例正常對(duì)照組中有1例突變，突變率為0.46%，T3394C突變率在兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4突變與家族史的關(guān)系兩組人群中可見(jiàn)明顯的DM家族史（χ2=1.041，P＜0.05）和母系遺傳傾向（χ2=3.840，P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1　線粒體ND1基因突變與糖尿病家族史的關(guān)系

2.5糖尿病組患者臨床資料比較T2DM組患者分為T(mén)3394C突變陽(yáng)性組和T3394C突變陰性組，兩組之間在性別、年齡、BMI、FBG、P2BG、HbA1c、血清C肽及治療方法方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但兩組之間的起病年齡差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

2.6DNA測(cè)序結(jié)果將T2DM組5例疑似突變陽(yáng)性標(biāo)本及正常對(duì)照組8例無(wú)突變標(biāo)本的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后直接正向測(cè)序，對(duì)有T3394C突變的標(biāo)本再次進(jìn)行反向測(cè)序驗(yàn)證，證明所有T2DM組樣本的T3394C突變結(jié)果可靠。見(jiàn)圖3。

圖3　PCR產(chǎn)物直接測(cè)序結(jié)果

3　討論

線粒體DNA直接暴露在氧化磷酸化過(guò)程所產(chǎn)生的自由基中，同時(shí)組蛋白保護(hù)的缺乏，DNA修復(fù)酶的相對(duì)不足，因此線粒體DNA比核DNA更容易受到損傷，突變率比核DNA高10～20倍，在老年人群中突變率尤為高〔9〕。60歲以上的人群中糖尿病的患病率超過(guò)10%，糖尿病總?cè)巳旱?0%以上為老年糖尿病患者〔10〕。線粒體ND1基因T3394C突變是一種錯(cuò)義突變，可引起線粒體呼吸鏈ND1亞單位中的一個(gè)中性的酪氨酸被親水性的組氨酸取代。該突變可改變ND1空間構(gòu)型，使NADH脫氫酶活性下降，ATP合成減少，導(dǎo)致胰島β細(xì)胞能量供應(yīng)不足，從而影響胰島素分泌，參與2型糖尿病的發(fā)生〔11〕。

1996年，HIRAI等首次報(bào)道日本2型糖尿病患者群存在mtDNA T3394C突變，其突變率為4.90%，正常人群為1.30%〔12〕。國(guó)內(nèi)外不同的研究表明，線粒體ND1基因T3394C突變?cè)赥2DM人群中發(fā)生率為3.00%～6.00%，在正常對(duì)照組人群發(fā)生率為0.00%～2.06%〔13-15〕。本研究結(jié)果顯示大理白族老年人2型糖尿病組中線粒體ND1基因T3394C突變率為2.50%，正常對(duì)照組中基因突變率僅為0.46%，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從而認(rèn)為線粒體ND1基因3394T→C突變與大理白族老年2型糖尿病的發(fā)病相關(guān)。進(jìn)一步分析老年2型糖尿病ND1基因T3394C突變患者的臨床資料，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)突變并沒(méi)有影響到糖尿病患者的BMI、FBG、P2BG、HbA1c、血清C肽的變化及治療方法等方面。但是，線粒體ND1基因T3394C突變陽(yáng)性組糖尿病患者的起病年齡比突變陰性組患者更低，兩組差異極顯著，且突變陽(yáng)性患者的母系遺傳特征明顯。

目前對(duì)于云南大理白族人群線粒體遺傳結(jié)構(gòu)與其他地區(qū)民族的差異及其與相關(guān)疾病關(guān)系的研究還不是特別清楚，本實(shí)驗(yàn)初步明確了線粒體ND1基因T3394C突變與這一群體中老年2型糖尿病患者之間的相關(guān)性，對(duì)大理白族老年人2型糖尿病的治療指導(dǎo)和病情預(yù)測(cè)具有一定的指導(dǎo)意義。本研究表明，線粒體ND1基因T3394C點(diǎn)突變可能是云南大理老年白族人群2型糖尿病的致病因素，在多因素的共同作用下，誘導(dǎo)糖尿病的發(fā)生，且具有母系遺傳的特點(diǎn)。

綜上所述，老年人2型糖尿病的病因復(fù)雜，國(guó)內(nèi)外不同民族由于遺傳背景和生活方式等多方面的不同，導(dǎo)致線粒體DNA突變率存在較大差異，需要更多樣本的深入研究來(lái)進(jìn)一步證實(shí)，為老年人2型糖尿病患者提供風(fēng)險(xiǎn)預(yù)報(bào)〔16〕。本研究對(duì)大理白族地區(qū)老年人2型糖尿病早發(fā)現(xiàn)、早治療、減少糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生具有一定的臨床意義。

表2　T2DM患者線粒體ND1基因突變（+）和突變（-）組間臨床資料比較

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The Correlation between Point Mutation of T3394C in Mitochondrial ND1 Gene and Patients with Type 2 Diabetes Mellitus in Aged Bai Minorities in Dali

Yang Yongqin1，2，Yang Zefang1，Chen Yali1，Ouyang Wenjun1，Yang Jiani1，Zhang Xiaojuan3，Xiong Wei1，2*
（1.Pre-clinical College，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China；2.Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D，Dali，Yunnan 671000，China；3.Respiratory Department，Dali Teaching hospital of Dali University，Dali，Yunnan 671000，China）

Objective:To investigate the correlation between point mutation of T3394C in mitochondrial NADH ND1 gene and patients with type 2 diabetes mellitus in aged Bai minorities in Dali.Methods:200 unrelated individuals with type 2 diabetes mellitus（T2DM group）which were randomly chosen among aged Bai minorities in Dali，Yunnan，and 218 aged cases with normal glucose tolerance without DM family history（Control group）were inspected.Polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP）technology were used for screening.Results:The point mutation T3394C in mitochondrial ND1 gene were found in 5 cases in T2DM group（2.50%），while only 1 case in control group（0.46%），and there were significant differences between two groups（P＜0.05）.Mitochondrial ND1 gene T3394C point mutation in patients with type 2 diabetes mellitus showed obvious maternal inheritance characteristics.Conclusions:The point mutation of T3394C in the mitochondrial DNA ND1 gene may be related to the occurrence of T2DM in aged Bai minorities in Dali.

mitochondrial ND1 gene；type 2 diabetes mellitus；T3394C mutation；Bai minority

R587.1

A

2096-2266（2016）10-0030-05

（責(zé)任編輯李楊）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81560458）；云南省教育廳科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目（2014Z126）；大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院大學(xué)生科研基金資助項(xiàng)目（201502）；云南省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃資助項(xiàng)目（201408）；大理大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目（BSKY2012018）

2015-12-09

2016-02-29

楊勇琴，講師，主要從事基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究.

*通信作者：熊偉，副教授，博士.