楊　敏，潘興嬌，江　靜，姚玉婷，趙　洋，周　濃，*

（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理671000；2.重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶404000）

不同產(chǎn)地栽培掌葉大黃中游離蒽醌、結(jié)合蒽醌和總蒽醌量的差異分析

楊敏1，潘興嬌1，江靜2，姚玉婷2，趙洋2，周濃1，2*

（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理671000；2.重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶404000）

目的：測定不同產(chǎn)地的栽培掌葉大黃藥材中游離蒽醌、總蒽醌及結(jié)合蒽醌的含量，為其藥材質(zhì)量評價和資源合理利用提供科學(xué)依據(jù)。方法：采用Agela Venusil XBP-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇-0.1%磷酸溶液（75∶25）為流動相，流速為1.0 mL/min，檢測波長為254 nm，柱溫為35℃，對11批掌葉大黃藥材進(jìn)行測定，并對測定結(jié)果進(jìn)行聚類分析。結(jié)果：不同產(chǎn)地的栽培掌葉大黃均含有5種蒽醌類衍生物，甘肅禮縣上坪質(zhì)量最優(yōu)。采用聚類分析能將不同產(chǎn)地的11批掌葉大黃藥材分為3類。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)考察了不同產(chǎn)地掌葉大黃的質(zhì)量差異，可為大理蒼山地區(qū)掌葉大黃的質(zhì)量評價及規(guī)范化種植提供參考。

掌葉大黃；不同產(chǎn)地；蒽醌；高效液相色譜法；含量測定；聚類分析

［DOI］10.3969/j.issn.2096-2266.2016.10.003

大黃始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是我國的四大中藥之一，應(yīng)用歷史悠久，是一味瀉熱毒、蕩積滯、行瘀血的良藥。大黃含有蒽醌類衍生物、苷類化合物、鞣質(zhì)類、有機(jī)酸類、揮發(fā)油類等化學(xué)成分，其中蒽醌類化合物為其質(zhì)量指標(biāo)成分，包括具有抑菌作用的游離蒽醌（如大黃酚、大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚等）以及具有瀉下作用的結(jié)合蒽醌（如雙蒽酮苷和單糖苷）〔1〕。

大黃是多種蓼科大黃屬的多年生植物的合稱，為多基原藥材，《中國藥典》（2015版）〔2〕規(guī)定藥材大黃應(yīng)來自掌葉大黃Rheum palmatum L.、唐古特大黃Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.或藥用大黃Rheum officinale Baill.的干燥根和根莖。已有文獻(xiàn)報道掌葉大黃和唐古特大黃質(zhì)量較好，藥用大黃質(zhì)量較差〔3-4〕。而產(chǎn)地不同，大黃的質(zhì)量差異也較大。甘肅禮縣是掌葉大黃的傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)，種植歷史悠久，其中以銓水鄉(xiāng)一帶出產(chǎn)的大黃最負(fù)盛名，簡稱“銓黃”。禮縣大黃的主產(chǎn)區(qū)為8個鄉(xiāng)∶沙金、白關(guān)、白河、銓水、橋頭、草坪、上坪、洮坪。目前，大理蒼山地區(qū)也在種植掌葉大黃，大理市花甸壩地方國營藥材場種植掌葉大黃面積已達(dá)數(shù)千畝〔5〕。禮縣大黃多生于海拔2 000 m左右排水良好的高山坡地，而大理市花甸壩坐落在蒼山十九峰中最北的云弄、滄浪兩峰之間，海拔2 900 m，壩內(nèi)溪水匯集，以種植藥材和養(yǎng)殖牲畜為主。本試驗(yàn)采用HPLC法，對11批不同產(chǎn)地的禮縣大黃和大理產(chǎn)掌葉大黃中游離蒽醌、結(jié)合蒽醌和總蒽醌的含量進(jìn)行測定，并對測定結(jié)果進(jìn)行聚類分析，為大理蒼山地區(qū)掌葉大黃的質(zhì)量評價及規(guī)范化種植提供參考。

1　儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；KH-300GTDV型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；R-300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）；AE240型天平（德國Mettler Toledo公司）。

蘆薈大黃素對照品（純度≥98%，批號110795-200806）、大黃酸對照品（純度≥98%，批號110757-200206）、大黃素對照品（純度≥98%，批號110756-200110）、大黃酚對照品（純度≥98%，批號110796-201017）、大黃素甲醚對照品（純度≥98%，批號110758-200912）、對照藥材（批號121249-201003）均購自中國食品藥品檢定研究院，甲醇為色譜純、水為娃哈哈牌純凈水、其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2010年7月從甘肅禮縣各鄉(xiāng)收集8批掌葉大黃藥材，2010年9月從云南大理花甸壩藥材種植基地收集3批掌葉大黃藥材。經(jīng)重慶三峽學(xué)院周濃副教授鑒定，11批藥材均為掌葉大黃RheumpalmatumL.的干燥根和根莖。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件流動相∶甲醇-0.1%磷酸溶液（75%-25%）；流速∶1.0 mL/min；色譜柱∶Agela Venusil XBP-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫∶35℃；波長∶254 nm；進(jìn)樣量∶20 μL。對照品和供試品的色譜圖見圖1。并對方法學(xué)（線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率試驗(yàn)）進(jìn)行了考察，結(jié)果均符合分析要求〔6〕。

圖1　對照品及樣品的HPLC圖

2.2對照品溶液制備精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對照品適量，置于容量瓶中，加甲醇溶解定容，制成濃度為含蘆薈大黃素2.185μg/mL、大黃酸0.770μg/mL、大黃素0.986μg/mL、大黃酚2.028 μg/mL、大黃素甲醚0.515 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3供試品溶液的制備

2.3.1游離蒽醌供試品溶液取掌葉大黃樣品各粉末（過四號篩）約0.20 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇35 mL，室溫浸泡2 h，密塞，超聲30 min，過濾，重復(fù)1次，合并提取液，回收溶劑至干，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜?0 mL，即得。

2.3.2總蒽醌供試品溶液精密量取“2.3.1項(xiàng)”濾液2 mL，置100 mL燒瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸溶液15 mL，超聲處理10 min，再加三氯甲烷15 mL，加熱回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，15 mL/次，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状贾盟≈形崛芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.4線性關(guān)系考察精密吸取對照品溶液1、2、5、10、15、20 μL進(jìn)樣，得回歸方程為Y=5 402.5X-5.376 5（蘆薈大黃素，r=0.999 9）；Y=2 363X-1.047 3（大黃酸，r=0.999 9）；Y=3 178.8X+2.741 6（大黃素，r= 0.999 8）；Y=5 031X+9.126 2（大黃酚，r=0.999 9）；Y=1 676.1X-2.339 6（大黃素甲醚，r=0.999 6）。結(jié)果表明，蘆薈大黃素在0.002 5～1.000 0 μg、大黃酸在0.002 5～1.000 0 μg、大黃素在0.003 0～1.200 0 μg、大黃酚在0.0060～2.4000μg、大黃素甲醚在0.0030～1.200 0 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.5精密度試驗(yàn)取對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計算，RSD≤0.27%，表明儀器精密度良好。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)取同一掌葉大黃樣品6份，制備游離蒽醌和總蒽醌供試品溶液，進(jìn)樣測定，供試品溶液中5種蒽醌衍生物的RSD≤2.95%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一掌葉大黃樣品，制備游離蒽醌和總蒽醌供試品溶液，分別于0、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣測定，供試品溶液中5種蒽醌衍生物的RSD≤2.53%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8加樣回收率試驗(yàn)精密稱取已知含量的掌葉大黃樣品，每份約0.10 g，分別精密加入一定量的5種蒽醌衍生物對照品，制備游離蒽醌和總蒽醌供試品溶液各9份，進(jìn)樣測定，游離蒽醌供試品溶液中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均回收率為96.23%、106.96%、95.29%、96.29%、95.44%，RSD≤2.24%；總蒽醌供試品溶液中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均回收率為101.24%、98.94%、96.37%、98.97%、97.76%，RSD≤2.55%。

2.9樣品測定按“2.1”色譜條件和“2.3”供試品溶液的制備方法對11批不同產(chǎn)地的掌葉大黃和對照藥材進(jìn)行含量測定，含游離蒽醌以蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的總量計，含總蒽醌以蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的總量計，用總蒽醌量與游離蒽醌量的差值，作為結(jié)合蒽醌的量。見表1。

表1　不同產(chǎn)地掌葉大黃中蒽醌含量的比較（mg/g，n=3）

各種游離蒽醌（游離蘆薈大黃素、游離大黃酸、游離大黃素、游離大黃酚、游離大黃素甲醚）均在產(chǎn)地S8含量最高，且均顯著高于其它地區(qū)（P＜0.05）。游離蘆薈大黃素在產(chǎn)地S1、S3、S7和對照藥材S12中量含相對較少，但幾者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。游離大黃酸、游離大黃酚以及游離蒽醌總量在產(chǎn)地S7含量最低，且顯著低于其它地區(qū)（P＜0.05）。游離大黃素和游離大黃素甲醚在對照藥材S12含量最低，且顯著低于其他地區(qū)（P＜0.05）。結(jié)合蘆薈大黃素在產(chǎn)地S4和S7含量稍低，但兩者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。他在產(chǎn)地S9含量最高，顯著高于其它地區(qū)（P＜0.05）。結(jié)合大黃酸在產(chǎn)地S4含量最低，在對照藥材S12含量最高，與其他地區(qū)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)合大黃素在產(chǎn)地S7和對照藥材S12含量稍低，但兩者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。它在產(chǎn)地S8含量最高，顯著高于其他地區(qū)（P＜0.05）。結(jié)合大黃酚在產(chǎn)地S7含量最低，在產(chǎn)地S8含量最高，與其他地區(qū)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)合大黃素甲醚在產(chǎn)地S2含量最低，顯著低于其他地區(qū)（P＜0.05），它在產(chǎn)地S9和S10含量稍高，但兩者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)合蒽醌總量在產(chǎn)地S2和S7含量稍低，在產(chǎn)地S9和S10含量稍高，但各兩者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義?？傒祯诋a(chǎn)地S7含量最低，在產(chǎn)地S8含量最高，與其他地區(qū)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.10聚類分析分別取11批不同產(chǎn)地的掌葉大黃和對照藥材中的蒽醌含量測定結(jié)果進(jìn)行聚類分析。利用SPSS19.0版本軟件歐式距離平方（squared Euclidean distance）計算樣品間的相似系數(shù)，并用離差平方和法（Ward法）進(jìn)行系統(tǒng)聚類。見圖2。

圖2　不同產(chǎn)地掌葉大黃中蒽醌類含量聚類分析樹狀圖

由圖2可見，當(dāng)分類距離為10時，可將11批不同產(chǎn)地的掌葉大黃和對照藥材分為3類∶第一類有3批藥材，即S9、S10、對照藥材S12，此類樣品中游離蘆薈大黃素高于平均值，游離蒽醌總含量均低于平均值，結(jié)合蒽醌、總蒽醌含量均高于平均值；第二類有8批藥材，即S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S11，此類藥材中被測成分及總蒽醌量均遠(yuǎn)低于平均值；第三類有1批藥材，即S8，此類藥材中被測成分及總蒽醌含量均遠(yuǎn)高于平均值。見表2。

3　討論

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，甘肅禮縣上坪鄉(xiāng)的掌葉大黃（S8）質(zhì)量最優(yōu)。這與銓水鄉(xiāng)大黃品質(zhì)最好的記載不一致，可能是由于不同產(chǎn)地掌葉大黃的生長地域、采集時間、貯存條件不同引起次生代謝成分組成和含量的變化〔7-10〕。

《中國藥典》（2015版）大黃含量測定項(xiàng)下規(guī)定，總蒽醌含量不得少于1.5%、游離蒽醌含量不得少于0.20%。根據(jù)聚類分析的結(jié)果，第一類大理市花甸壩藥材場1隊(duì)（S9）、大理市花甸壩藥材場2隊(duì)（S10）、對照藥材（S12）和第三類甘肅禮縣上坪（S8）批次符合藥典規(guī)定，可為大理蒼山地區(qū)掌葉大黃的質(zhì)量評價及規(guī)范化種植提供參考。

表2　不同產(chǎn)地掌葉大黃中蒽醌類成分含量聚類分析的不同組別各組分的平均含量（mg/g，n=3）

〔1〕程小麗，魏勝利，劉春生，等.RP-HPLC-DAD同時測定大黃中9種有效成分的含量〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（18）：99-102.

〔2〕國家藥典委員會.中華人民共和國藥典臨床用藥須知：中藥飲片卷〔M〕.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2011.

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Difference Analysis of Free Anthraquinones，Combined Anthraquinones and Total Anthraquinones in Cultivated Rheum palmatum L.in Different Producing Areas

Yang Min1，Pan Xingjiao1，Jiang Jing2，Yao Yuting2，Zhao Yang2，Zhou Nong1，2*
（1.College of Pharmacy and Chemistry，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China；2.College of Life Science and Engineering，Chongqing Three Gorges University，Chongqing 404000，China）

Objective:To determine content of free anthraquinones，combined anthraquinones and total anthraquinones in cultivated Rheum palmatum L.in different producing areas，and to provide scientific basis for quality assessment and reasonable using.Methods: Agela Venusil XBP-C18column（4.6 mm×250 mm，5 μm）was used with the mobile phase of methanol-0.1%posphoric acid solution（75∶25）at the flow rate of 1.0 mL/min，the detection wavelength was set at 254 nm and the column temperature was 35℃.To determine the content of cultivated Rheum palmatum L.from 11 different producing areas，cluster analysis was carried out for the results.Results:5 kinds of anthraquinons exist in cultivated Rheum palmatum L.from different producing areas，in which cultivated Rheum palmatum L.from Lixian，Gangsu was the best.Cluster analysis divided cultivated Rheum palmatum L.from 11 different producing areas into 3 categories.Conclusion:This paper analyzes the quality of cultivated Rheum palmatum L.from different producing areas，it could provide reference for quality assessment and standardized planting of cultivated Rheum palmatum L.in Dali.

Rheum palmatum L.；different producing areas；anthraquinons；HLPC；determination；cluster analysis

R917

A

2096-2266（2016）10-0009-05

（責(zé)任編輯李楊）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81260622）；重慶三峽學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃資助項(xiàng)目（2014040）

2016-05-11

2016-06-06

楊敏，講師，主要從事藥物分析教學(xué)研究.

*通信作者：周濃，副教授.