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        紫茉莉提取物對(duì)乙醇誘導(dǎo)L-02肝細(xì)胞損傷的影響

        2016-11-18 03:31:21羅愛蓮程勝邦陳俊雅郭美仙
        大理大學(xué)學(xué)報(bào) 2016年10期
        關(guān)鍵詞:紫茉莉生藥抑制率

        羅愛蓮,程勝邦,沈 磊,陳俊雅,郭美仙

        (云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南大理671000)

        紫茉莉提取物對(duì)乙醇誘導(dǎo)L-02肝細(xì)胞損傷的影響

        羅愛蓮,程勝邦,沈磊,陳俊雅,郭美仙*

        (云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南大理671000)

        目的:研究紫茉莉提取物對(duì)乙醇體外誘導(dǎo)L-02肝細(xì)胞損傷的作用。方法:選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L-02肝細(xì)胞,以終濃度為100 mmol/L的乙醇誘導(dǎo)損傷8 h后,加入不同濃度的紫茉莉提取物,繼續(xù)培養(yǎng)16 h后,MTT法檢測(cè)乙醇對(duì)肝細(xì)胞的抑制率,酶標(biāo)法檢測(cè)培養(yǎng)液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)及超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。結(jié)果:8 mg/mL或更高生藥濃度的紫茉莉能減小乙醇對(duì)L-02肝細(xì)胞的抑制率,降低受損細(xì)胞培養(yǎng)液中的ALT和AST活性,增強(qiáng)SOD活性,減少M(fèi)DA含量。結(jié)論:紫茉莉提取物對(duì)乙醇誘導(dǎo)L-02肝細(xì)胞損傷有一定的保護(hù)作用。

        紫茉莉;乙醇;L-02肝細(xì)胞;保護(hù)作用

        [DOI]10.3969/j.issn.2096-2266.2016.10.002

        長(zhǎng)期大量飲酒或飲用含酒精飲料易造成酒精性肝損害,通常表現(xiàn)為酒精性肝炎、脂肪肝、肝硬化等〔1〕。酒精性肝損害已成為危害全球的公共衛(wèi)生問題,其發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì),但至今為止,仍未找到對(duì)其有效的防治藥物〔2〕。過氧化損傷是酒精性肝損害的公認(rèn)發(fā)病機(jī)制之一〔3〕。紫茉莉俗名地雷花、胭脂花等〔4〕,全草均可入藥,藥用價(jià)值高,收載于《本草綱目拾遺》?,F(xiàn)代研究表明紫茉莉具有抗氧化、抗癌、抗菌、收縮子宮平滑肌等多種藥理作用〔5-8〕。李凌智等〔9〕研究表明紫茉莉中含有抗氧化物質(zhì)——黃酮,黃酮對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝損傷有一定的保護(hù)作用。因此,本實(shí)驗(yàn)就紫茉莉提取物對(duì)乙醇誘導(dǎo)損傷的L-02肝細(xì)胞的影響進(jìn)行了研究。

        1 材料

        1.1樣品紫茉莉采于云南省大理市,由大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院張德全副教授鑒定為紫茉莉科紫茉莉?qū)僦参镒宪岳颍∕irabilis jalapa L.)。將紫茉莉洗凈,晾干,粉碎。稱取5 kg用無水乙醇冷浸提取3次,混合并濃縮冷浸液,得浸膏294.56 g(1 g浸膏約相當(dāng)于17 g生藥),冰箱保存?zhèn)溆谩?0〕。無菌條件下∶加藥前24 h配制母液,密封冰箱保存過夜;加藥前,用PBS(磷酸鹽緩沖液)稀釋母液,得81、27、9、3、1 mg/mL藥液〔10〕。

        1.2藥品與試劑RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司);MTT(噻唑藍(lán),Sigma公司),胰蛋白酶(Sigma公司),DMSO(二甲基亞砜,Sigma公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);0.25%胰蛋白酶和1%雙抗(Amresc公司生產(chǎn));谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒、超氧化物岐化酶測(cè)定試劑盒及丙二醛試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

        1.3儀器ES-315型高壓滅菌鍋(TOMY公司);3-111型培養(yǎng)箱(Thermo公司);AE-21型倒置生物數(shù)碼顯微鏡(MOTIC公司);0408-2型臺(tái)式低速離心機(jī)(上海醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司手術(shù)器械廠);多功能酶標(biāo)儀(BioTek公司)。

        2 方法

        2.1肝細(xì)胞(L-02)培養(yǎng)用含20%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基),置37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔1~2 d更換新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底部80%以上時(shí),以1∶2或1∶3進(jìn)行傳代,繼續(xù)置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

        2.2肝細(xì)胞損傷模型的建立以1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液種板(96孔板,90 μL/孔)。設(shè)正常組和3個(gè)濃度乙醇組,每組重復(fù)8孔,另設(shè)空白組8孔,加入完全培養(yǎng)基(90 μL/孔)。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,空白組和正常組加入完全培養(yǎng)基(10 μL/孔),乙醇低濃度組、乙醇中濃度組、乙醇高濃度組分別加入對(duì)應(yīng)濃度(500、1 000、2 000 mmol/L)的乙醇(10 μL/孔)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,去培養(yǎng)液,各孔加入5 mg/mL MTT(100 μL/孔),繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,去上清液,各孔加入DMSO(200 μL/孔),570 nm處檢測(cè)吸光度(A值),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,計(jì)算不同乙醇濃度下肝細(xì)胞抑制率。選擇能使肝細(xì)胞抑制率達(dá)到50%的乙醇濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)〔10-13〕。

        2.3紫茉莉提取物對(duì)乙醇損傷的L-02肝細(xì)胞的影響以1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液種板(96孔板,90 μL/孔)。設(shè)正常組、模型組、溶媒組和紫茉莉5個(gè)劑量組(A組、B組、C組、D組、E組),每組重復(fù)6孔,另設(shè)空白組6孔,加入完全培養(yǎng)基(90 μL/孔)。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,空白組和正常組各孔加入完全培養(yǎng)基(10 μL/孔),其余各組各孔加入1 000 mmol/L乙醇(10 μL/孔)。繼續(xù)培養(yǎng)8 h后,空白組、正常組和模型組各孔加入完全培養(yǎng)基(10 μL/孔),溶媒組各孔加入1%DMSO(10 μL/孔),紫茉莉A組、B組、C組、D組、E組分別依次加入對(duì)應(yīng)濃度(1、3、9、27、81 mg/mL)的紫茉莉提取物(10 μL/孔)。繼續(xù)培養(yǎng)16 h后,吸取培養(yǎng)液檢測(cè)ALT活性(波長(zhǎng)510 nm)、AST活性(波長(zhǎng)510 nm)及SOD活性(波長(zhǎng)450 nm)和MDA含量(波長(zhǎng)530 nm)。各孔加入5 mg/mL MTT(100 μL/孔),繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,去上清液,各孔加入DMSO(200 μL/孔),酶標(biāo)儀檢測(cè)A值(波長(zhǎng)570 nm),計(jì)算各組肝細(xì)胞抑制率〔10-13〕。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

        2.4數(shù)據(jù)處理所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)表示,用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和組間t檢驗(yàn)。

        3 結(jié)果與分析

        3.1不同濃度乙醇對(duì)L-02肝細(xì)胞抑制率的影響乙醇終濃度為50 mmol/L時(shí),肝細(xì)胞抑制率為32.22%,與正常組比較吸光度值明顯減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);乙醇終濃度為100 mmol/L和200 mmol/L時(shí),肝細(xì)胞抑制率分別為51.79%、71.95%,與正常組比較吸光度值均明顯減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。因此,選擇中濃度乙醇(1 000 mmol/L)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。見表1。

        表1 不同濃度乙醇對(duì)L-02肝細(xì)胞抑制率的影響

        表1 不同濃度乙醇對(duì)L-02肝細(xì)胞抑制率的影響

        注:與正常組比較△△P<0.01。

        分組正常組乙醇低濃度組乙醇中濃度組乙醇高濃度組終濃度/(mmol/L)—50 100 200 A值0.435±0.056 0.312±0.030△△0.220±0.055△△0.167±0.034△△細(xì)胞抑制率/%—32.22±6.04 51.79±7.93 71.95±4.63

        3.2紫茉莉?qū)σ掖紦p傷的L-02肝細(xì)胞抑制率的影響模型組肝細(xì)胞抑制率為53.38%,與正常組比較吸光度值明顯減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),表明造模成功。紫茉莉生藥終濃度為45.9 mg/mL時(shí)肝細(xì)胞抑制率為36.03%,與模型組比較明顯減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);紫茉莉生藥終濃度為137.7 mg/mL時(shí)肝細(xì)胞抑制率為27.21%,與模型組比較明顯減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

        表2 紫茉莉?qū)σ掖紦p傷的L-02肝細(xì)胞抑制率的影響(

        表2 紫茉莉?qū)σ掖紦p傷的L-02肝細(xì)胞抑制率的影響(

        注:與正常組比較△△P<0.01;與模型組比較*P<0.05,**P<0.01。

        分組正常組模型組溶媒組紫茉莉A組紫茉莉B組紫茉莉C組紫茉莉D組紫茉莉E組生藥終濃度/(mg/mL)——1.7 5.1 15.3 45.9 137.7 A值0.389±0.051 0.181±0.028△△0.185±0.027△△0.191±0.030△△0.192±0.046△△0.217±0.038△△0.249±0.041△△* 0.283±0.038△△**細(xì)胞抑制率/%—53.38±7.19 52.40±6.92 51.03±7.87 50.73±11.81 44.26±12.45 36.03±10.57* 27.21±9.68**

        3.3紫茉莉?qū)σ掖紦p傷的L-02肝細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT和AST活性的影響與正常組比較,模型組肝細(xì)胞ALT和AST活性均明顯增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),表明造模成功。紫茉莉生藥終濃度為15.3 mg/mL時(shí)肝細(xì)胞ALT和AST活性明顯減弱,與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。紫茉莉生藥終濃度為45.9 mg/mL和137.7 mg/mL時(shí)肝細(xì)胞ALT和AST活性均明顯減弱,與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

        表3 紫茉莉?qū)σ掖紦p傷的L-02肝細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT和AST活性的影響

        表3 紫茉莉?qū)σ掖紦p傷的L-02肝細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT和AST活性的影響

        注:與正常組比較△P<0.05,△△P<0.01;與模型組比較*P<0.05,**P<0.01。

        分組正常組模型組溶媒組紫茉莉A組紫茉莉B組紫茉莉C組紫茉莉D組紫茉莉E組生藥終濃度/(mg/mL)——1.7 5.1 15.3 45.9 137.7 ALT活性/(IU/L)1.71±0.29 3.42±0.50△△3.06±0.56△△2.97±0.48△△2.89±0.71△△2.63±0.42△△* 2.40±0.41△△** 2.27±0.45△** AST活性/(IU/L)2.12±0.20 3.76±0.58△△3.58±0.74△△3.41±0.65△△3.30±0.52△△3.02±0.45△△* 2.79±0.37△△** 2.56±0.43△**

        3.4紫茉莉?qū)σ掖紦p傷的L-02肝細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD活性及MDA含量的影響與正常組比較,模型組肝細(xì)胞SOD活性明顯減弱,MDA含量明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),表明造模成功。紫茉莉生藥終濃度為15.3 mg/mL時(shí)肝細(xì)胞SOD活性增強(qiáng),與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);紫茉莉生藥終濃度為45.9 mg/mL和137.7 mg/mL時(shí)肝細(xì)胞SOD活性均明顯增強(qiáng),與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。紫茉莉生藥終濃度為5.1 mg/mL時(shí)肝細(xì)胞MDA含量降低,與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);紫茉莉生藥終濃度為15.3 mg/mL、45.9 mg/mL和137.7 mg/mL時(shí)肝細(xì)胞MDA含量均明顯降低,與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表4。

        表4 紫茉莉?qū)σ掖紦p傷的L-02肝細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD活性及MDA含量的影響

        表4 紫茉莉?qū)σ掖紦p傷的L-02肝細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD活性及MDA含量的影響

        注:與正常組比較△△P<0.01;與模型組比較*P<0.05,**P<0.01。

        分組正常組模型組溶媒組紫茉莉A組紫茉莉B組紫茉莉C組紫茉莉D組紫茉莉E組生藥終濃度/(mg/mL)——1.7 5.1 15.3 45.9 137.7 SOD活性/(U/mL)44.08±7.46 17.32±4.15△△17.61±3.79△△18.54±3.69△△20.90±4.31△△22.65±3.47△△* 25.16±2.39△△** 31.80±5.60△△** MDA含量/(nmol/mL)52.37±9.94 121.80±17.34△△118.31±12.50△△111.27±8.49△△104.23±11.98△△* 97.35±12.64△△** 82.06±8.35△△** 70.81±9.53△△**

        4 討論

        乙醇經(jīng)肝臟代謝,轉(zhuǎn)化為乙醛和多種氧自由基,氧自由基攻擊肝細(xì)胞膜,導(dǎo)致肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷,產(chǎn)生過氧化物(MDA等)。肝細(xì)胞過氧化損傷時(shí),細(xì)胞膜通透性增加,ALT和AST由肝細(xì)胞內(nèi)釋放,細(xì)胞培養(yǎng)液中的ALT和AST活性增強(qiáng)。因此,檢測(cè)肝細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量、ALT和AST活性,可以判斷肝細(xì)胞被乙醇氧化損傷的程度和藥物治療肝臟損傷的效果??寡趸窼OD活性的大小,可以反應(yīng)肝細(xì)胞抗氧化能力的強(qiáng)弱,肝細(xì)胞代謝乙醇的過程中需要消耗大量的SOD。因此,檢測(cè)肝細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD活性,可以反映細(xì)胞抗氧化能力的增強(qiáng)和藥物治療肝臟損傷的效果。

        實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)紫茉莉生藥終濃度達(dá)到或高于45.9 mg/mL時(shí),可以使乙醇對(duì)L-02肝細(xì)胞的抑制率減??;當(dāng)紫茉莉生藥終濃度達(dá)到或高于15.3 mg/mL時(shí),可以使受損的L-02肝細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT和AST活性減弱,SOD活性增強(qiáng),MDA含量減少。表明紫茉莉提取物可以減少乙醇對(duì)L-02肝細(xì)胞的損害,即紫茉莉提取物對(duì)乙醇損傷的L-02肝細(xì)胞有一定保護(hù)作用,提示紫茉莉在治療酒精性肝損傷方面具有一定的價(jià)值。其機(jī)制可能與抗氧化有關(guān),有待進(jìn)一步研究。

        〔1〕陳成偉.藥物與中毒性肝病〔M〕.上海:上??茖W(xué)技術(shù)出版社,2002:500-505.

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        〔4〕中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志:第40卷〔M〕.北京:科學(xué)出版社,1990.

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        〔11〕廖于,李龍輝,左國(guó)慶,等.體外誘導(dǎo)的酒精性脂肪肝細(xì)胞模型的建立、鑒定及機(jī)制探討〔J〕.重慶醫(yī)學(xué),2010,39(8):902-904.

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        Effect of Extracts form Mirabilis jalapa on the Damaged L-02 Human Embryo Hepatocytes Induced by Ethanol

        Luo Ailian,Cheng Shengbang,Shen Lei,Chen Junya,Guo Meixian*
        (Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D,Dali,Yunnan 671000,China)

        Objective:To study the effect of extracts form Mirabilis jalapa on the damaged L-02 human embryo hepatocytes induced by ethanol.Methods:L-02 human embryo hepatocytes in logarithmic phase were chosen and damaged by ethanol at a final concentration of 100 mmol/L.After 8 hours,different concentrations of the extracts form Mirabilis jalapa were added in.After 16 hours of cultivation,MTT method was used to observe inhibition rate of L-02 human embryo hepatocytes damaged by ethanol,and Elisa method was used to detect the activity of glutamic-pyruvic transaminase(ALT),glutamic-oxalacetic transaminase(AST)and superoxide dismutase(SOD),and the content of malonaldehyde(MDA)in nutrient solution.Results:8 mg/mL or higher crude herbal concentrations of Mirabilis jalapa can significantly decrease inhibition rate of ethanol-induced damaged L-02 cells,obviously reduce ALT and AST activity,increase SOD activity and decrease MDA content in the culture for damaged cells.Conclusion:Extracts form Mirabilis jalapa has protective effect on the damaged L-02 cells induced by ethanol.

        Mirabilis jalapa;ethanol;L-02 human embryo hepatocytes;protective effect

        R285

        A

        2096-2266(2016)10-0005-04

        (責(zé)任編輯李楊)

        大理大學(xué)大學(xué)生科研基金資助項(xiàng)目(YHXSKY201310)

        2016-01-13

        2016-03-08

        羅愛蓮,2011級(jí)藥學(xué)專業(yè)本科生.

        *通信作者:郭美仙,實(shí)驗(yàn)師.

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