林雀躍 張榮林 羅 軼 張 慧

廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所，廣西 南寧 530021

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藿香正氣合劑的HPLC指紋圖譜研究

林雀躍 張榮林 羅 軼 張 慧

廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所，廣西 南寧 530021

目的：建立藿香正氣合劑的HPLC指紋圖譜。方法：樣品直接進樣，以橙皮苷為參照峰，通過紫外檢測器(波長280nm)對藿香正氣合劑進行HPLC指紋圖譜分析。結(jié)果：對20批藿香正氣合劑供試品進行檢測，建立了該藥品的HPLC指紋圖譜并標示了15個共有指紋峰。各共有峰相對保留時間RSD均在1.00%以內(nèi)。結(jié)論：該方法準確、重現(xiàn)性好，為藿香正氣合劑的進一步質(zhì)量標準化研究和控制提供依據(jù)。

藿香正氣合劑；指紋圖譜；HPLC

藿香正氣合劑由廣藿香、紫蘇葉、白芷、白術(shù)、陳皮、茯苓、桔梗、甘草、大腹皮、姜厚樸、姜半夏等13味藥材組成，具有解表化濕、理氣和中的功效，臨床用于脾胃虛寒而外感風寒、胸膈悶滿。收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑》第7冊中，原標準沒有含量測定項[1]。為更好的控制該藥品的質(zhì)量，張志平等[2]采用薄層掃描法測定了藿香正氣合劑中百秋李醇的含量；也有企業(yè)用高效液相色譜法測定橙皮苷含量作為其質(zhì)控指標，但關(guān)于藿香正氣合劑指紋圖譜方面的研究未見報道。中藥指紋圖譜是一種實現(xiàn)對中藥多組分，多指標分析的有效方法，該技術(shù)具有整體性、特征性、模糊性和穩(wěn)定性的特征，可從整體上把握中藥的質(zhì)量[3]。從藿香正氣類制劑指紋圖譜研究的進展看[4-7]，藿香正氣水的指紋圖譜研究較多，但藿香正氣水以揮發(fā)油類成分為主，而藿香正氣合劑則以水溶性成分為主，因此其指紋圖譜的研究思路和方法與藿香正氣水截然不同。研究通過實驗摸索，采用樣品直接進樣的方法對藿香正氣合劑進行HPLC指紋圖譜分析，并在方法學考察的基礎上，建立了藿香正氣合劑的指紋圖譜，同時，以保留時間為指標，通過對比藿香正氣合劑、藥材樣品提取液及缺某味藥材陰性樣品HPLC指紋圖譜，對15個共有峰進行歸屬指認。該法具有操作簡單、準確、重現(xiàn)性好等特點，為其質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent1200型液相色譜儀(真空脫氣裝置、四元泵、自動進樣器和DAD檢測器、UWD紫外檢測器)；MILLI-PROA純水處理器。

1.2 試劑 橙皮苷(批號：110721-201115，中國食品藥品檢定研究院)；藿香正氣合劑20批(無糖型10批的批號：131215、131216、131217、131220、131221、131222、131224、131225、131226、131227，樣品序號為S1～S10；有糖型10批，樣品序號為S11～S20)、藿香正氣合劑陰性樣品13批(缺廣藿香陰性、缺紫蘇葉陰性、缺白芷陰性、缺白術(shù)陰性、缺陳皮陰性、缺茯苓陰性、缺桔梗陰性、缺甘草陰性、缺大腹皮陰性、缺厚樸陰性、缺半夏陰性、缺生姜陰性、缺大棗陰性)均由廣西邦琪藥業(yè)集團有限公司提供；單味藥材提取液13批(廣藿香提取液、紫蘇葉提取液、白芷提取液、白術(shù)提取液、陳皮提取液、茯苓提取液、桔梗提取液、甘草提取液、大腹皮提取液、厚樸提取液、半夏提取液、生姜提取液、大棗提取液)按藿香正氣合劑制法單獨提取。乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱：CAPCELLPAK MGⅡ C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)梯度洗脫程序(見表1)；流速：1.0mL/min；檢測波長：280nm；柱溫：35℃；進樣量：10μL。理論板數(shù)按橙皮苷峰計算應不低于5000。

表1 流動相洗脫程序

2.2 供試品溶液的制備 取樣品溶液過0.45μm微孔濾膜，即得。

2.3 測定方法 精密吸取供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，測定并記錄液相色譜圖，分析該色譜圖60min內(nèi)的色譜峰信息，20批樣品均出現(xiàn)15個明顯的液相色譜峰，將其確定為共有峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。

2.4 精密度實驗 取藿香正氣合劑，連續(xù)測定6次，以橙皮苷峰作為參照峰(S峰)，考察各共有峰的相對保留時間(Tr=Ti/Ts)、相對峰面積(Ar=Ai/As)的一致性。結(jié)果表明：各共有峰相對保留時間RSD為0.04%～0.39%；相對峰面積RSD為0.56%～2.28%。

2.5 穩(wěn)定性實驗 取藿香正氣合劑，分別在0、8、16、24、32、40h檢測，結(jié)果在40h內(nèi)，各共有峰相對保留時間RSD為0.07%～1.13%，相對峰面積RSD為0.38%～2.28%，表明樣品溶液打開包裝后在40h內(nèi)測定穩(wěn)定。

2.6 重復性實驗 取藿香正氣合劑6份，按“2.1”項實驗條件分析，結(jié)果6份樣品各共有峰相對保留時間RSD為0.02%～0.17%，相對峰面積的RSD為0.47%～2.00%。表明方法的重復性很好。

2.7 耐用性實驗 考察3個品牌色譜柱[CAPCELLPAK MGⅡC18、Kromasil 100-5 C18、Inertsil ODS-3 C18(4.6mm×250mm，5μm)]，結(jié)果藿香正氣合劑各共有峰相對保留時間的RSD為0.57%～5.61%，相對峰面積的RSD為0.23%～5.72%。表明采用相同儀器不同色譜柱，對少數(shù)共有峰的出峰時間及峰面積有影響，但影響不大。

3 結(jié)果與討論

3.1 HPLC指紋圖譜的確立及共有峰歸屬 在“2.1”項的實驗條件下，對20批藿香正氣合劑進行分析，確定了15個共有峰(見圖1)，建立了藿香正氣合劑HPLC指紋圖譜。以橙皮苷峰為參照峰，其保留時間和峰面積分別定為1.00，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積(見表2、表3)。從數(shù)據(jù)上可以看出：不同批次樣品同一色譜共有峰的相對面積存在差異，這可能與各單味藥材的來源、采集時間和制藥工藝的穩(wěn)定性有關(guān)。

表2 20批藿香正氣合劑HPLC各共有峰相對保留時間表

序號峰1峰2峰3峰4峰5峰6峰7峰8峰9峰10峰11峰12峰13峰14峰15S10.19520.35250.38030.40140.46240.48410.51120.58850.79190.86330.90090.93371.00001.20241.2408S20.19590.35380.38140.40270.46380.48530.51260.58920.79320.86450.90150.93441.00001.20341.2425S30.19480.35270.38210.40210.46370.48480.51250.58850.79330.86240.90180.93531.00001.20401.2436S40.19520.35230.38040.40120.46210.48440.51130.58810.79210.86180.90070.93411.00001.20211.2402S50.19560.35280.38110.40200.46250.48410.51130.58810.79170.86210.90110.93421.00001.20331.2415S60.19510.35210.38050.40110.46140.48440.51150.58840.79180.86090.90050.93401.00001.20201.2396S70.19460.35140.37960.40000.46090.48400.51130.58740.79070.86050.90070.93421.00001.20261.2410S80.19590.35840.37820.40750.47050.48450.51300.59130.79820.86700.90030.93321.00001.19331.2398S90.19910.36490.38350.41310.47560.48910.51690.59330.79780.86750.90180.93411.00001.20061.2409S100.19490.35250.38040.40190.46320.48440.51190.58820.79310.86240.90140.93451.00001.20341.2428S110.19490.35370.38430.40460.46540.48530.51310.58950.79560.86230.90170.93521.00001.20361.2440S120.19480.35280.38240.40360.46410.48550.51310.58940.79500.86160.90200.93551.00001.20421.2439S130.19480.35270.38210.40360.46370.48530.51280.58870.79430.86090.90160.93551.00001.20451.2440S140.19480.35250.38130.40380.46410.48510.51280.58930.79490.86140.90190.93561.00001.20461.2441S150.19450.35250.38160.40380.46450.48570.51340.58970.79490.86140.90180.93551.00001.20401.2438S160.19490.35330.38360.40430.46440.48570.51370.59010.79570.86190.90210.93571.00001.20481.2448S170.19440.35250.38180.40350.46380.48480.51260.58900.79470.86050.90160.93551.00001.20451.2438S180.19460.35250.38150.40360.46430.48560.51320.58920.79460.86090.90190.93571.00001.20451.2443S190.19480.35280.38180.40410.46460.48540.51340.58920.79440.86110.90180.93551.00001.20531.2448S200.19480.35260.38130.40360.46430.48570.51350.58930.79480.86130.90210.93581.00001.20451.2442均值0.19520.35360.38150.40360.46450.48520.51280.58920.79410.86230.90150.93491.00001.20311.2427RSD/%0.520.850.370.690.700.230.250.220.250.230.060.090.000.210.14

表3 20批藿香正氣合劑HPLC各共有峰相對峰面積表

對15個共有峰進行歸屬分析可知：峰1由白芷、白術(shù)、陳皮等9味藥材貢獻；峰2由廣藿香、紫蘇葉、厚樸等3味藥材貢獻；峰3由陳皮、大腹皮、厚樸等3味藥材貢獻；峰4由白芷、白術(shù)、甘草、厚樸等4味藥材貢獻；峰5由廣藿香、紫蘇葉、白芷、甘草、厚樸等5味藥材貢獻；峰6由陳皮、厚樸2味藥材貢獻；峰7由廣藿香、甘草、厚樸、陳皮、紫蘇葉等5味藥材貢獻；峰8由紫蘇葉、厚樸2味藥材貢獻；峰9、峰10同由紫蘇葉、甘草2味藥材貢獻；峰11為陳皮藥材特征峰；峰12為厚樸藥材特征峰；峰13為橙皮苷峰；峰14為廣藿香藥材特征峰；峰15為甘草藥材特征峰。(見圖2、表4)

表4 藿香正氣合劑15個共有峰歸屬表

序號廣藿香紫蘇葉陳皮厚樸甘草白芷白術(shù)大腹皮茯苓桔梗半夏生姜大棗峰1//√/√√√/√√√√√峰2√√/√/////////峰3//√√///√/////峰4///√√√√//////峰5√√/√√√///////峰6//√√/////////峰7√√√√√////////峰8/√/√/////////峰9/√//√////////峰10/√//√////////峰11//√//////////峰12///√/////////峰13//√//////////峰14√////////////峰15////√////////合計4668732111111

3.2 實驗條件的選擇 在DAD檢測器中查看全波長色譜圖，發(fā)現(xiàn)樣品于280nm波長下得到的色譜峰數(shù)量較多且峰面積較大，因此確定280nm作為檢測波長。對比了Ⅰ：乙腈-水、Ⅱ：甲醇-0.1%磷酸、Ⅲ：乙腈-0.1%磷酸3個流動相系統(tǒng)，結(jié)果顯示系統(tǒng)Ⅲ的峰對稱性較好、分析時間較短。藿香正氣合劑以水溶性成分為主，極性較大，故考察了Ⅰ：原液直接進樣、Ⅱ：D101型大孔樹脂柱富集凈化、Ⅲ：聚酰胺柱富集凈化3種制備方法。結(jié)果表明采用D101型大孔樹脂柱及聚酰胺柱對本品進行富集純化效果不顯著，最終確定用藿香正氣合劑樣品直接進樣。

對15個共有峰的Fi值進行排序，可知峰15>峰3>峰8>峰5>峰6>峰2>峰1>峰4>峰12>峰7>峰14>峰9>峰10>峰11>峰13。峰13、11變化差異最小，兩峰均為陳皮的特征峰，表明陳皮藥材的質(zhì)量較穩(wěn)定，且藿香正氣合劑制備工藝對陳皮藥材成分的提取影響較小，也驗證了選用陳皮特征峰(橙皮苷)為參照峰評價藿香正氣合劑質(zhì)量是合理的。峰15的變化差異最大，其次為峰3、8、5、6、2。其中峰15為甘草特征峰，后五個峰均由厚樸參與貢獻，表明，甘草及厚樸藥材對藿香正氣合劑質(zhì)量的影響最大，這與每批投料的甘草、厚樸藥材質(zhì)量良莠不齊有關(guān)，因此，把好該兩味藥材進廠的質(zhì)量關(guān)是關(guān)鍵。14號峰為君藥廣藿香的特征峰，各批次相對峰面積值較為穩(wěn)定，可通過監(jiān)控多批藿香正氣合劑的14號峰相對峰面積值來確定一個數(shù)值范圍作為其質(zhì)控指標。

4 結(jié)論

從20批藿香正氣合劑HPLC指紋圖譜分析結(jié)果來看，無糖型及有糖型樣品HPLC指紋圖譜相似度高，表明蔗糖輔料的使用對該藥品的化學成分無顯著影響；采用樣品直接進樣分析的方法最大程度的保留了該藥品中化學成分的種類，節(jié)省了樣品提取的時間，操作簡單；參與藿香正氣合劑HPLC指紋圖譜共有峰貢獻排名前五的藥材依次為厚樸、甘草、紫蘇葉、陳皮及廣藿香，表明這五味藥材的質(zhì)量直接影響該制劑的質(zhì)量，可通過測定五味藥材HPLC指紋圖譜，篩選出質(zhì)量穩(wěn)定的優(yōu)質(zhì)藥材進行投料，進而達到控制藿香正氣合劑質(zhì)量的目的。研究表明，藿香正氣合劑HPLC指紋圖譜能有效控制該制劑質(zhì)量。

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(編輯：陶希睿)

HPLC Fingerprint of Huoxiang Zhengqi Mixture

LIN Queyue ZHANG Ronglin LUO Yi ZHANG Hui

Guangxi Institute for Food and Drug Control,Nanning 530021,China

Objective To establish the HPLC fingerprint of Huoxiang Zhengqi Mixture. Methods The constituents of Huoxiang Zhengqi Mixture were analyzed by HPLC with UV detector (wavelength 280nm) using direct sampling and hesperidin used as the

ubstance. Results HPLC fingerprint of Huoxiang Zhengqi Mixture,15 common peaks were established on the basis of system atic methodology after 20 batches of samples were tested Variation in the relative retention time of 15 identified common peaks were within 1.00% range. Conclusion The analytical method for Huoxiang Zhengqi Mixture is precise and reliable.The research would be helpful to offer an effective pattern for quality control of Huoxiang Zhengqi Mixture.

Huoxiang Zhengqi Mixture;Fingerprint;HPLC

2016-08-24

林雀躍(1983-)，女，漢族，主管中藥師，碩士，從事中藥材及中成藥質(zhì)量評價。E-mail：linqueyue@163.com

R284

A

1007-8517(2016)20-0043-05