蔣碧美，吳煥婷，梁海燕，夏漢武，賴俊新，姚彩蘭，宋偉科，陳　明，江金初，羅滿玉

（廣州市增城區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣東廣州　511300）

農(nóng)村犬狂犬病不同免疫程序的免疫效果比較研究

蔣碧美，吳煥婷，梁海燕，夏漢武，賴俊新，姚彩蘭，宋偉科，陳明，江金初，羅滿玉

（廣州市增城區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣東廣州511300）

［目的］評估廣州市增城地區(qū)農(nóng)村犬狂犬病抗體水平現(xiàn)狀，比較不同免疫程序?qū)υ摰貐^(qū)農(nóng)村犬狂犬病免疫效果的影響。［方法］采用問卷調(diào)查與抽樣檢測相結(jié)合的方法，抽取該地區(qū)一定數(shù)量的農(nóng)村犬，隨機(jī)分成4組：春秋兩季2次免疫組（A組）、僅春季免疫組（B組）、僅秋季免疫組（C組）和春秋兩季均不免疫組（D組）。對不同組別的試驗犬只實施不同的免疫程序，并進(jìn)行試驗前后兩次血清采樣和抗體ELISA檢測。［結(jié)果］試驗前的采樣檢測結(jié)果顯示：最后一次免疫在2014年10月和11月的試驗犬只，抗體合格率分別是35.7%、36.4%；不同性別、不同年齡的試驗犬只抗體合格率均無統(tǒng)計學(xué)差異。試驗后的采樣檢測結(jié)果顯示：A組、B組、C組和D組的抗體合格率分別為100.0%、66.7%、94.6%和34.8%，春防免疫與秋防免疫主效應(yīng)明顯，交互效應(yīng)不明顯。試驗犬只抗體滴度（Titer）均值和抗體合格率統(tǒng)計分析顯示：A組與B組、A組與D組、B組與C組均差異顯著；B組與D組Titer均值差異不顯著，抗體合格率差異顯著。［結(jié)論］綜合認(rèn)為，犬的性別和年齡對免疫效果影響較??；全年免疫一次的抗體合格率達(dá)不到世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的及國家要求的全年維持在70%以上的標(biāo)準(zhǔn)；實行全年兩次免疫，能有效提升犬只狂犬病的抗體保護(hù)水平。

狂犬??；免疫程序；免疫效果調(diào)查；析因設(shè)計

狂犬病是由狂犬病病毒引起的一種高度致死性人獸共患 傳染?。?］，主要表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，病死率幾乎為100%。我國狂犬病主要流行于農(nóng)村，占總病例數(shù)的50%～70%［2］。疫苗接種是預(yù)防狂犬病最主要的方法［3］。世界衛(wèi)生組織（WHO）提出，當(dāng)動物群體的狂犬病有效免疫率超過70%時，即可控制動物狂犬病的發(fā)生和流行［4-5］。在廣州市增城區(qū)，農(nóng)村犬占絕大多數(shù)。近年來該地區(qū)嚴(yán)格按照國家相關(guān)規(guī)定，實行每年春季和秋季兩次集中免疫。但目前全年春秋兩季集中免疫的效果如何，不是十分清楚。此外，能否在有效防控狂犬病的前提下，將全年兩次免疫調(diào)整為全年集中免疫一次，以便節(jié)約人力和物力，也有待研究證實。為此開展本次研究，比較分析不同免疫程序的免疫效果，以期為該地區(qū)有效防治狂犬病和調(diào)整免疫政策提供技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1 疫苗

廣州市動物疫病預(yù)防控制中心招標(biāo)采購的“瑞貝康”狂犬病滅活疫苗（G52株）（原產(chǎn)地法國梅里亞），批號：L415085。

1.2 調(diào)查對象和抽樣分組方案

采用三階段隨機(jī)抽樣方法，對廣州市增城區(qū)的農(nóng)村犬進(jìn)行調(diào)查。首先在該區(qū)11個鎮(zhèn)街中隨機(jī)抽取4個，然后從每個被抽中的鎮(zhèn)街中隨機(jī)抽取2個村，每個村隨機(jī)抽20只犬，共160只。用Microsoft Excel的RANDBETWEEN（1，160）函數(shù)生成160個隨機(jī)整數(shù)，每只試驗犬只對應(yīng)1個隨機(jī)整數(shù)，用其對應(yīng)的這個隨機(jī)整數(shù)除以4，余數(shù)分別為0、1、2、3。余數(shù)相同的歸為一組，分別定義為A組、B組、C組、D組。最終得到的4組犬只數(shù)量分別為A組48只、B組38只、C組41只、D組33只。

1.3 調(diào)查時間和方法

采用問卷調(diào)查和抽樣檢測相結(jié)合的方法。2015年4月，通過查看試驗犬只免疫記錄和對犬主人進(jìn)行問卷調(diào)查，獲得試驗犬只年齡、性別、最后一次免疫狂犬病疫苗時間等相關(guān)信息。對試驗犬只進(jìn)行唯一性編號和分組標(biāo)識，佩戴相應(yīng)的標(biāo)識牌，并進(jìn)行第一次（試驗前）血清采樣。在不改變試驗犬只飼養(yǎng)習(xí)慣和環(huán)境條件的前提下，對4組試驗犬只分別作不同的免疫程序干預(yù)（表1）。秋防免疫后1個月（2015年11月）進(jìn)行第二次（試驗后）血清采樣。各組試驗犬只兩次采樣數(shù)及失訪數(shù)見表2。通過訪問犬主人得知，失訪原因均為丟失。故本研究是基于未失訪的132只犬進(jìn)行的血清檢測結(jié)果比較分析。

表1　不同組別試驗犬只的免疫程序

表2　各組試驗犬只采樣數(shù)量及失訪情況統(tǒng)計

1.4 樣品保存

按常規(guī)方法，采集犬血液并進(jìn)行血清分離，然后置于-20 ℃保存待用，使用前血清經(jīng)56 ℃熱滅活30 min。

1.5 檢測試劑和方法

法國辛百克斯狂犬病抗體ELISA試劑盒，購自廣州悅翔生物科技有限公司（批號：14 SRAB3 23）；世界衛(wèi)生組織（WHO）狂犬病標(biāo)準(zhǔn)血清，購自狂犬病WHO參考實驗室。檢測過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書規(guī)定操作，并進(jìn)行定量和定性判定。定量判定方法：用法國辛百克斯公司提供的Excel格式軟件計算待檢樣品抗體滴度，用Titer值表示。定性判定方法：按照世界動物衛(wèi)生組織（OIE）《陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》和抗體檢測試劑盒的說明判定，免疫狂犬病疫苗的犬，其抗體滴度≥0.6 EU/mL：判定為免疫抗體合格；抗體滴度＜0.6 EU/mL，判定為免疫抗體不合格。

1.6 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)用Microsoft Excel和SPSS 18.0進(jìn)行分析和統(tǒng)計。

2　結(jié)果

2.1 試驗犬只第一次采樣的抗體滴度和抗體合格率比較

2.1.1 組間抗體水平比較。4組狂犬病抗體滴度均值分別是0.965、0.973、1.002、1.379，單因素方差分析無統(tǒng)計學(xué)差異（p=0.794＞0.05）。4組狂犬病抗體合格率分別為38.1%、26.7%、35.1%、30.4%，卡方檢驗無統(tǒng)計學(xué)差異（Pearsonχ2=1.170，p=0.760＞0.05）。詳見表3。

表3　各組第一次采樣檢測的狂犬病抗體水平

2.1.2 性別間抗體水平比較。公犬平均抗體合格率為37.5%，母犬抗體合格率為30.3%，卡方檢驗差異不顯著（Pearsonχ2=0.760，p=0.383＞0.05）。各組性別組成見表4。

表4　不同處理組試驗犬只性別分布

2.1.3 年齡間抗體水平比較。試驗犬只中，年齡最大的10歲，最小的0.25歲，中位數(shù)為2.00。Kolmogorov-Smirnova正 態(tài) 性 檢 驗p=0.000＜ 0.01，不服從正態(tài)分布（圖1）。以中位數(shù)為基準(zhǔn)，把試驗犬只分成兩組：一組年齡≤2.00，另一組年齡＞2.00。第一次采樣檢測結(jié)果顯示：兩組抗體合格率分別是29.1%、41.3%，卡方檢驗無統(tǒng)計學(xué)差異（Pearsonχ2=2.019，p=0.155＞0.05）。

圖1　試驗犬只年齡分布

2.1.4 最后一次不同免疫日期間的抗體水平比較。84只（2014年10月）、33只（2014年11月）、1只（2015年3月）、1只（2015年5月），其余13只最后一次免疫時間不詳。第一次采樣檢測結(jié)果顯示前兩者抗體合格率分別是35.7%（30/84）、36.4%（12/33）。

2.2 試驗犬只第二次采樣的抗體滴度和抗體合格率比較

4組狂犬病抗體滴度均值分別是29.103、6.458、20.895、3.370（表5）。單因素方差分析結(jié)果認(rèn)為4組均值不全相等（p=0.000＜0.01）。進(jìn)一步兩兩比較的結(jié)果見表6。

表5　各組第二次采樣的狂犬病抗體水平

表6　各組第二次采樣的狂犬病抗體滴度（Titer）均值Tamhane兩兩比較

4組狂犬病抗體合格率分別為100.0%、66.7%、94.6%、34.8%（表5）。卡方檢驗認(rèn)為4組試驗犬只抗體合格率不全相等（似然比χ2=50.281，p=0.000＜0.01）。進(jìn)一步兩兩比較的結(jié)果見表7。

表7　各組第二次采樣的狂犬病抗體合格率兩兩比較

2.3 春防、秋防后各組試驗犬只抗體滴度增長值析因分析

在析因設(shè)計實驗研究中，主效應(yīng)是不考慮其他研究變量的變化或?qū)⑵渌芯孔兞康淖兓?yīng)平均掉，單獨(dú)考察一個自變量對因變量的變化效應(yīng)。交互效應(yīng)則是反映兩個或兩個以上自變量相互依賴、相互制約，共同對因變量的變化發(fā)生影響［6］。

用第二次采樣的抗體Titer值減去第一次采樣的抗體Titer值評價春防、秋防后試驗犬只抗體滴度增長情況。4組試驗犬只兩次免疫后抗體Titer增長均值見圖2。

圖2　不同組別兩次免疫后Titer增長均值

對其結(jié)果進(jìn)行析因分析發(fā)現(xiàn)：春防免疫主效應(yīng)明顯（F=7.175，p=0.008＜0.01）；秋防免疫主效應(yīng)明顯（F=85.626，p=0.000＜0.01）；春防免疫和秋防免疫交互效應(yīng)無統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.176，P=0.280＞0.05）。

3 討論

本研究第一次采樣檢測的結(jié)果顯示，4組試驗犬只抗體滴度均值和抗體合格率均無統(tǒng)計學(xué)差異，說明在隨機(jī)分組下，各組狂犬病基礎(chǔ)抗體水平?jīng)]有明顯差異。第二次采樣檢測結(jié)果顯示，免疫的A組、B組、C組試驗犬只抗體合格率均與未免疫的D組有統(tǒng)計學(xué)差異，并且春防免疫與秋防免疫主效應(yīng)均明顯。說明注射狂犬病滅活疫苗對試驗犬只產(chǎn)生抗體有積極作用，能有效提高免疫抗體保護(hù)水平。這與覃勇等［7］的研究結(jié)論一致，同時也間接證明了該地區(qū)采購的疫苗質(zhì)量可靠，免疫實施有效。

國內(nèi)學(xué)者李堅等［8］對上海市青浦區(qū)散養(yǎng)犬免疫后不同時間的免疫抗體合格率進(jìn)行比較研究，認(rèn)為在免疫180 d后仍然有75%（6/8）的犬只免疫抗體合格。而在本調(diào)查研究中，2015年4月第一次采樣檢測結(jié)果顯示，最后一次免疫時間在2014年10月和11月的試驗犬只，抗體合格率分別是35.7%、36.4%，已經(jīng)不能維持在70%以上。造成結(jié)論差異的原因可能有以下幾方面：一是研究方法不同，前者的研究為干預(yù)實驗，而本研究為橫斷面調(diào)查；二是兩者所用疫苗類型、生產(chǎn)商以及疫苗質(zhì)量可能不一樣；三是選用的檢測方法和判定標(biāo)準(zhǔn)不一樣。

按α= 0.05水準(zhǔn)，本研究第二次采樣檢測結(jié)果顯示：春防、秋防都免疫的A組抗體保護(hù)水平比春防單次免疫的B組要好，比未免疫的D組也要好；免疫6個月后的B組抗體滴度和未免疫的D組相當(dāng)，免疫6個月后的B組抗體合格率為66.7%，低于70%。

按α= 0.05水準(zhǔn)，本研究析因分析顯示：春防免疫組犬只抗體滴度增長均值（16.811）大于未免疫組犬只（10.942）；秋防免疫組犬只抗體滴度增長均值（24.015）大于未免疫組犬只（3.738）；春防免疫與秋防免疫不存在交互效應(yīng)?？梢姶?、秋兩季免疫效果獨(dú)自作用明顯，相互作用并不顯著。

基于以上分析，本研究認(rèn)為，在不改變目前狂犬病免疫程序和所用疫苗的前提下，全年實行單次免疫，抗體水平維持時間較短，其合格率達(dá)不到WHO推薦及國家要求的70%以上的標(biāo)準(zhǔn)，存在自然感染和傳染的風(fēng)險。全年實行兩次免疫，特別是在前一次免疫抗體下降到較低水平時，再補(bǔ)免一針，能有效提升犬只狂犬病抗體保護(hù)水平。

本研究還對犬只的年齡、性別對抗體合格率的影響進(jìn)行分析，結(jié)論是年齡、性別因素對犬只抗體影響不大，這與譚海等［9］對廣州市犬狂犬病抗體橫斷面調(diào)查的結(jié)論一致。另外，由于受客觀條件所限，本研究未能完全消除失訪、錯誤免疫試驗犬只，以及最后一次免疫時間不一致等因素帶來的偏倚。

致謝：感謝參與此次實驗研究的工作人員，包括廣州市增城區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所荔城分 所、石灘分所、中新分所、派潭分所的工作人員及犬主人；感謝廣州市動物衛(wèi)生監(jiān)督所的張海明和鐘錦輝在實驗設(shè)計、數(shù)據(jù)分析及文章寫作方面給予的指導(dǎo)和幫助。

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［9］ 譚海，段曉冬，張海明，等. 2014年廣州市區(qū)犬狂犬病橫斷面調(diào)查［J］. 中國動物檢疫，2015，32（2）：14-18.

（責(zé)任編輯：朱迪國）

Comparative Study on Immune Effects of Rabies Vaccination towards Rural Canines by Different Immunization Procedures

Jiang Bimei，Wu Huanting，Liang Haiyan，Xia Hanwu，Lai Junxin，Yao Cailan，Song Weike，Chen Ming，Jiang Jinchu，Luo Manyu
（Zengcheng Animal Health Inspection Institution， Guangzhou，Guangdong 511300）

［Objective］To evaluate the current situation of rabies antibody level of rural canines in Zengcheng district and to compare the immune effects under different vaccination procedures. ［Methods］By the methods of questionnaire survey and sampling detection，a certain number of rural canines were randomly sampled and allocated into four groups（group A，B，C and D）. Then different vaccination procedures were conducted for these experimental dogs of the above four groups，and serum samples were collected and detected by ELISA for twice. ［Results］In the fi rst detection before experimentation，the qualification rates of rabies antibodies were 35.7% and 36.4% respectively，when the experimental dogs were vaccinated in October and November 2014 for the last time. Gender and age were of no signifi cant statistical difference. Results of the second detection （after experimentation）showed that the qualifi cation rates of rabies antibodies of group A（immunized for twice in spring and autumn），group B（only immunized in spring），group C（only immunized in autumn）and group D（no immunization）were 100.0%，66.7%，94.6% and 34.8%，respectively. The data demonstrated that the main effect of immunization in spring and autumn were obvious，but not for the interaction effect. The statistical analysis on the mean antibody titers and qualifi ed rates showed that the differences between group A and B，group A and D，group B and C were signifi cant，the qualifi ed rates ofrabies antibodies between group B and D were obvious，but not for the mean antibody titers.［Conclusion］In overall consideration，the immune effects were less affected by gender and age. Once vaccination per year was not enough to maintain the antibody level of the standard（ratio of 70% in the whole year）according to the recommendation of WHO and request of China. And the immunological protection for rural canines would be enhanced effectively under twice immunization per year.

Rabies；vaccination procedures；immune effect investigation；factorial design

S851.33

B

1005-944X（2016）11-0001-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.11.001

羅滿玉