張洪軍，王會(huì)敏，李秀慧，張秀麗，劉國臣，陳瑞蘭，曹　瑞

（1. 河北省圍場縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河北圍場　068450；2. 青島瑞爾生物技術(shù)有限公司，山東青島　266100）

不同方法檢測奶牛結(jié)核病的結(jié)果分析

張洪軍1，王會(huì)敏1，李秀慧1，張秀麗1，劉國臣1，陳瑞蘭1，曹瑞2

（1. 河北省圍場縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河北圍場068450；2. 青島瑞爾生物技術(shù)有限公司，山東青島266100）

采用常規(guī)皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)（TST）、牛全血干擾素試驗(yàn)方法（IFN-?）及膠體 金3種檢測方法，對2個(gè)奶牛場的600頭奶牛進(jìn)行結(jié)核病檢測，發(fā)現(xiàn)結(jié)核病陽性率均偏高，表明奶牛場結(jié)核病感染較嚴(yán)重。將3種方法檢測結(jié)果 的敏感性、特異性及符合率進(jìn)行比較，結(jié)果表明：單獨(dú)使用PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)方法或膠體金方法在牛結(jié)核病的診斷方面存在特異性及符合率差的缺點(diǎn)；用IFN-?實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測，可以提高特異性，避免因假陽性造成的誤殺，適合在本地區(qū)推廣應(yīng)用。

奶牛結(jié)核??；皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)；?-干擾素；膠體金

結(jié)核病是一種由結(jié)核分支桿菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的人獸共患病，也是一種慢性傳染病［1-2］。結(jié)核分枝桿菌分為牛型、禽型和人型3種菌型，其中牛型與人型可以互相感染，而禽型也可以感染牛和人［3］。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）已將牛結(jié)核病列入須報(bào)告動(dòng)物疫病名錄，我國將其列為二類動(dòng)物疫病。在家畜中，奶牛最易感染結(jié)核病。牛結(jié)核病的存在嚴(yán)重威脅著人類健康。據(jù)報(bào)道，人結(jié)核病患者中約有30%由牛結(jié)核分枝桿菌引起［4］?？刂圃摬〉陌l(fā)生直接關(guān)系到奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和人民的身體健康，因此檢測并且淘汰感染奶牛具有重要意義。

牛全血干擾素實(shí)驗(yàn)方法是一種診斷牛結(jié)核病的新方法。澳大利亞在消滅牛結(jié)核病的行動(dòng)中就采 用了該方法，最終于1997年消滅了牛結(jié)核?。?］。此方法也相繼在歐盟及美國等發(fā)達(dá)國家得到運(yùn)用。我國目前主要采用皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)方法（Tuberculin skin test，TST）。TST方法特異性差，僅采用TST方法，極易造成假陽性率高［6-7］。同時(shí)，我國對患病牛處理后的經(jīng)濟(jì)補(bǔ)償偏低，這對基層動(dòng)物疫病預(yù)防控制部門的工作帶來了巨大壓力。以往的實(shí)驗(yàn)是通過某一種方法初篩檢出陽性個(gè)體，再用其他方法對陽性個(gè)體進(jìn)行復(fù)檢而確診。本實(shí)驗(yàn)的特別之處是運(yùn)用皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)、?-干擾素ELISA檢測試劑盒及膠體金等3種方法對每一個(gè)實(shí)驗(yàn)個(gè)體進(jìn)行檢測，然后對檢測結(jié)果進(jìn)行對比分析。

1　材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用的奶牛來自兩個(gè)規(guī)模飼養(yǎng)場。其中1號(hào)場遠(yuǎn)離城鎮(zhèn)，環(huán)境相對良好且是自繁自育的良種繁育場；2號(hào)場是一個(gè)養(yǎng)殖小區(qū)，在城鎮(zhèn)周圍，不斷有奶牛個(gè)體的購入和銷售。在各場中隨機(jī)選取300頭不同發(fā)育階段的奶牛，其中100頭泌乳牛、100頭育成牛、100頭犢牛。牛型PPD（批號(hào)201502）購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，100頭/瓶；禽型PPD（批號(hào)200603）購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，100頭/瓶；牛結(jié)核分枝桿菌?-干擾素檢測試劑盒（批號(hào)P201603-001）購自青島瑞爾生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牛型結(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)（TST）。按照國家標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)》（GB/ T 18645—2002）的要求操作。結(jié)果判定：局部有明顯的炎性反應(yīng)，皮厚差≥4.0 mm為陽性反應(yīng)；局部炎性反應(yīng)不明顯，4.0 mm＞皮厚差≥2.0 mm為疑似反應(yīng)；無炎性反應(yīng)，皮厚差＜2.0 mm為陰性反應(yīng)。疑似反應(yīng)牛只于第1次檢疫60 d后進(jìn)行復(fù)檢，其結(jié)果仍為疑似反應(yīng)時(shí)，60 d后再復(fù)檢，如仍為疑似反應(yīng)，則判為陽性。

1.2.2 牛全血干擾素試驗(yàn)方法（牛IFN-?）。采集奶牛的全血，用肝素鈉抗凝；在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入PPD抗原各100 μL，然后將采集的全血分裝至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板（1.5 mL/孔，4孔/份樣品），無菌加人PBS（陰性抗原對照）、禽PPD、牛PPD，保證各抗原與分裝血液充分混勻；將含有血液和抗原的細(xì)胞培養(yǎng)板在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h。吸取400 μL上層血漿，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，-20 ℃貯存待檢。牛結(jié)核分枝桿菌?-干擾素檢測結(jié)果判定：牛型提純PPD的OD-陰性抗原的OD≥0.1，且牛型提純PPD的OD-禽型提純PPD的OD≥0.1判為陽性；牛型提純PPD的OD-陰性抗原的 OD＜0.1或牛型提純PPD的OD-禽型提純PPD的OD＜0.1判為陰性。

1.2.3 結(jié)核桿菌檢測試劑盒試驗(yàn)（膠體金法）。定性檢測結(jié)核菌的分泌性蛋白質(zhì)。當(dāng)有兩條線同時(shí)出現(xiàn)時(shí)，可判斷為陽性；只有一條對照線出現(xiàn)時(shí)，則判斷為陰性。反應(yīng)時(shí)間15 min，即可判讀結(jié)果。

2　結(jié)果與分析

從表1結(jié)果可知，無論采用哪種檢測方法，1號(hào)場的陽性率都偏高。由此可判定1號(hào)場是一個(gè)被嚴(yán)重污染的養(yǎng)殖場，場內(nèi)環(huán)境中存在大量的結(jié)核分枝桿菌，即使場內(nèi)個(gè)體是自繁自育，也會(huì)有不同程度的感染。3種檢測方法在奶牛不同生長階段的檢測結(jié)果有差異。

膠體金檢測結(jié)果顯示，犢牛、泌乳牛和育成牛的感染率存在較大差異，犢牛陽性率最低，僅為3.33%（10/300）。這可能是犢牛剛剛出生，接觸污染源的時(shí)間短，加之自身的抵抗力，沒有成為感染個(gè)體，體內(nèi)不產(chǎn)生抗體，所以膠體金方法檢測不到。

表1　1號(hào)奶牛場結(jié)核病檢測結(jié)果

IFN-?檢測方法是檢測T淋巴細(xì)胞分泌的干擾素，可以看到3種牛的檢測結(jié)果基本一致，由此也可以判斷此場是一個(gè)被污染的奶牛場， 其中部分奶牛已經(jīng)染病或者是攜病個(gè)體，需要對廠區(qū)及所有奶牛進(jìn)行凈化處理。

從表2結(jié)果可知，2號(hào)養(yǎng)殖場的陽性率雖然低于1號(hào)場，但整體上還是較高，存在較大的患病風(fēng)險(xiǎn)。此外，2號(hào)奶牛場在不斷購進(jìn)各時(shí) 期奶牛的同時(shí)，也在不斷出售奶牛，且還有散養(yǎng)戶寄存的犢牛，牛只流動(dòng)量大，環(huán)境相對開放，外界患病或者攜帶病源的個(gè)體極易進(jìn)入。

從表2中還可以看出，用TST方法檢測不同年齡段的奶牛，發(fā)現(xiàn)泌乳牛的陽性率為0，育成牛為13.33%，犢牛最大為16.67%。這可能是此養(yǎng)殖場外來寄養(yǎng)的犢牛是攜病個(gè)體，從而使?fàn)倥ｊ栃詸z出率偏高。IFN-?檢測也能印證這點(diǎn)。據(jù)考察，2號(hào)奶牛場臨近村莊，這也可能是陽性檢出率較高的原因之一。和84.33%，高于徐賢坤［9］、朱冬冬等［5］的檢測結(jié)果。IFN-?試驗(yàn)和膠體金試驗(yàn)比較，除了特異性較高外，敏感性及符合率均比較低；膠體金試驗(yàn)和TST試驗(yàn)比較，膠體金試驗(yàn)存在過多的假陽性。因此，建議在以后的工作當(dāng)中，更宜將TST試驗(yàn)與IFN-?檢測聯(lián)合用于奶牛結(jié)核病的檢疫，單一方法檢測不可取。

表2　2號(hào)奶牛場結(jié)核病檢測結(jié)果

表3　IFN-?、TST方法和膠體金方法檢測靈敏性、特異性、符合率的比較

以上2個(gè)奶牛場存在TST與IFN-?方法檢測陽性、膠體金檢測陰性的個(gè)體。原因可能是藥物注入皮下或者表皮深部組織，PPD抗原成分與其他物質(zhì)（卡介苗和其他結(jié)合分支桿菌）抗原成分相同，易發(fā)生交叉反應(yīng)，出現(xiàn)假陽性；也可能由于記憶性免疫反應(yīng)出現(xiàn)假陽性或可能是免疫個(gè)體受抑制。

出現(xiàn)TST與IFN-?方法檢測現(xiàn)陰性、膠體金檢測陽性的個(gè)體，說明所檢測的個(gè)體不一定是結(jié)核病，可能是感染過結(jié)核分枝桿菌，或者注射過相關(guān)的藥物致使體內(nèi)產(chǎn)生結(jié)核抗體，但并不一定是患病個(gè)體。

對2個(gè)奶牛場各300份奶牛樣本進(jìn)行了牛結(jié)核病IFN-?試驗(yàn)、TST試驗(yàn)和膠體金試驗(yàn)的符合率、敏感性和特異性比較。按照如下公式計(jì)算：符合率=（真陽性數(shù)+真陰性數(shù)）/被檢總數(shù)；敏感性=真陽性數(shù)/（真陽性數(shù)+假陰性數(shù)）；特異性=真陰性數(shù)/（真陰性數(shù)+假陽性數(shù)）。

1號(hào)奶牛場牛結(jié)核病IFN-?試驗(yàn)、TST試驗(yàn)相比的敏感性、特異性和符合率分別為76.93%、80.00%和80.00%；IFN-?試驗(yàn)和膠體金試驗(yàn)比較，其敏感性、特異性和符合率分別為44.00%、80.00%和50.00%；2號(hào)奶牛場牛結(jié)核病IFN-?試驗(yàn)和TST試驗(yàn)比較，其敏感性、特異性和符合率分別為69.23%、100.00%和86.67%；IFN-?試驗(yàn)和膠體金試驗(yàn)比較，其敏感性、特異性和符合率分別為38.46%、82.35%和63.33%（表3）。

王麗霞等［8］用IFN-?試驗(yàn)和TST試驗(yàn)比較的敏感性、特異性和符合率分別為78.26%、89.09%

［1］ 雷劍明，謝芝勛，謝志勤，等. 牛分枝桿菌廣西分離株CFP-10、ESAT_6、MPB70基因的克隆與序列分析［J］. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，40（9）：1229-1233.

［2］ 謝志勤，謝芝勛，劉加波，等. 牛分枝桿菌廣西分離株ESAT-6基因鑒定及遺傳進(jìn)化分析［J］. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，41（8）：827-830.

［3］ 徐賢坤，熊毅，韋達(dá)有，等. ?一干擾素ELISA檢測方法在廣西牛結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用［J］. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，44（4）：667-670.

［4］ Dye C D，Scheels S M S，Dolin P D，et a1. Global burden of tuberculosis estimated incidence，prevalence，and mortality by country［J］. Joumal of American Medical Association，1999，282（7）：677-686.

［5］ 朱冬冬，孫泉云，曹傳閨，等. 牛 ?-干擾素 EIA 與TST 檢測牛結(jié)核病的比較等. 上海畜牧獸醫(yī)通訊，2010（2）：14-15.

［6］方杰元，黃國敏，韋春葵，等. 廣西某奶牛場水牛結(jié)核病的檢疫報(bào)告［J］. 畜牧與獸醫(yī)，2004，36（1）：35.

［7］謝志勤，謝芝勛，劉加波，等. 變態(tài)反應(yīng)檢測水牛結(jié)核病標(biāo)準(zhǔn)的探索［J］. 畜牧與獸醫(yī)，2010，42（12）：60-63.

［8］ 王麗霞，李愛華，王會(huì)杰，等. 兩種方法檢測奶牛結(jié)核病的比較分析［J］. 中國動(dòng)物保健，2015（17）：66-68.

［9］ 徐賢坤，黃小武，藍(lán)紀(jì)，等. 兩種奶牛結(jié)核病檢測方法的比較研究［J］. 畜牧與獸醫(yī)，2010，42（2）：29-33.

（責(zé)任編輯：朱迪國）

Results Analysis of Cow Tuberculosis Detection by Different Methods

Zhang Hongjun1，Wang Huimin1，Li Xiuhui1，Zhang Xiuli1，Liu Guochen1，Chen Ruilan1，Cao Rui2
（1. Weichang Animal Disease Prevention and Control Center，Weichang，Hebei 068450；2. Qingdao Riel Biological technology Co.，Ltd，Qingdao，Shandong 266100）

In order to compare the detection results of cow tuberculosis（TB）by different test methods，the tuberculin skin test（TST），the whole blood interferon-gamma（IFN-?）test and colloidal gold detection were applied in detecting TB of 600 cows from two farms. Results showed that t he positive rates of TB by the three methods were all on the high side，which indicated the infection of TB in the cow farms was serious. Comparisons were made in aspects of sensitivity，specifi city and coincidence rates of the testing results by the three methods. The results showed that the sensitivity and specifi city were defi cient when only using PPD intradermal allergy or colloidal gold to detect cow TB，and the specifi city could be improved by the IFN-? test，avoiding manslaughter of cows due to false positive results，hence the IFN-? test was suitable to be applied in this area.

cow tuberculosis；tuberculin skin test；IFN-?；colloidal gold

S855.2

B

1005-944X（2016）11-0086-03

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.11.023