方翌，張鈴，蔡巧燕，彭軍

（福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122）

夏枯草乙醇提取物抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

方翌，張鈴，蔡巧燕，彭軍

（福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122）

目的觀察夏枯草乙醇提取物（EESP）對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8的增殖及凋亡的影響。方法MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，Hoechst 33258檢測(cè)細(xì)胞凋亡，GeXP系統(tǒng)分析EESP給藥后細(xì)胞周期素D 2和周期蛋白依賴性激酶4的基因表達(dá)水平。結(jié)果EESP抑制HCT-8細(xì)胞活力呈劑量依賴效應(yīng)，Hoechst 33258染色結(jié)果顯示1 mg／m L的EESP誘導(dǎo)的HCT-8細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)明顯染色質(zhì)凝聚等凋亡特征，GeXP系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)EESP顯著抑制CCND 2的水平，而CDK4與對(duì)照組比較無顯著性差異。結(jié)論EESP誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8凋亡，通過抑制CCND2表達(dá)，干擾細(xì)胞周期素家族復(fù)合物的形成，抑制細(xì)胞增殖。

夏枯草提取物；結(jié)腸癌；GenomeLabTM遺傳分析系統(tǒng)；細(xì)胞周期素D2

夏枯草、白花蛇舌草等中草藥具有抑制腫瘤生長(zhǎng)作用［1-4］。本研究從細(xì)胞周期相關(guān)基因入手，探討EESP對(duì)HCT-8細(xì)胞增殖的抑制作用。前期研究發(fā)現(xiàn)夏枯草乙醇提取物能上調(diào)半胱氨酸蛋白酶家族caspase8、caspase9及bax的表達(dá)水平［5］，本研究用GeXP系統(tǒng)分析細(xì)胞周期素D2（cyclin D2，CCND2）和周期蛋白依賴性激酶4（cyclin-dependent kinase 4，CDK4），從細(xì)胞周期相關(guān)基因角度探討夏枯草對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的影響。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1儀器蒸汽滅菌器（上海市博迅有限公司）；RE-520A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海市亞榮生化儀器廠）；TDL-50B低速離心機(jī)（湖南省湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（香港利康儀器設(shè)備有限公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州市安泰儀器設(shè)備有限公司）；超微量高精度紫外／可見光分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo公司）；E lx800酶標(biāo)儀（美國(guó)基因有限公司）；IX70倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯株式會(huì)社）；PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；GeXP系統(tǒng)（美國(guó)Beckman Coulter公司）。

1.2試劑RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素（美國(guó)Hyclone公司）；胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；DNA聚合酶、MTT粉末（美國(guó)Sigma公司）；Hoechst33258染色試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；CEQTM分離凝膠、GeXP基因表達(dá)試劑盒（美國(guó)Beckman Coulter公司）。

1.3藥物與細(xì)胞株夏枯草購于福建中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂中藥房；結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-8（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1制備EESP研磨夏枯草全草，用85%乙醇溶解（100 g／L），過濾收集粗提液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮提取液，真空干燥后獲得EESP干粉。以二甲基亞砜（DMSO）溶解干粉制備母液（0.6 g／mL），高壓滅菌后-20℃保存?zhèn)溆?。干預(yù)液的制備：培養(yǎng)基稀釋母液，干預(yù)液DMSO最終濃度≤0.3%。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)在500 mL的不完全RPMI-1640培養(yǎng)基中加入50 g的鏈霉素、500 U／mL的青霉素、55 mL的胎牛血清，0.22μm微孔濾膜過濾獲得完全培養(yǎng)基。37℃、5%CO2、完全培養(yǎng)HCT-8細(xì)胞。

2.3藥物干預(yù)胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT-8細(xì)胞，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以1×105個(gè)／mL密度接種于96孔板（100μL／孔）或12孔板（1 mL／孔）中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)60%，用0、0.25、0.50、1 mg／mL的EESP干預(yù)細(xì)胞48 h。

2.4細(xì)胞活力檢測(cè)吸去96孔板的各孔干預(yù)液，每孔加入0.25 mg／mL的MTT溶液200μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置4 h。吸去MTT溶液，每孔加入DMSO 100μL，充分振蕩15 min溶解結(jié)晶，570 nm處測(cè)吸光度值，計(jì)算細(xì)胞活力。

2.5Hoechst 33258檢測(cè)細(xì)胞凋亡吸去12孔板的各孔干預(yù)液，PBS洗3次，每孔加入1 m L的4%多聚甲醛溶液，靜置20 min。吸去各孔溶液，PBS洗3次。每孔加入1 mL的Hoechst33258染色液，避光反應(yīng)20 min。吸去各孔溶液，PBS洗3次，最終每孔加入1 mL的PBS，熒光顯微鏡下觀察拍照。

2.6RNA提取和定量以1 mg／mL的EESP干預(yù)HCT-8細(xì)胞后，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移細(xì)胞及培養(yǎng)液到1.5 mL的離心管中，2 000 r／min離心5 min。離心后棄上清，PBS溶液漂洗沉淀3次，Trizol法提取細(xì)胞總RNA。20μL DEPC處理水溶解RNA，－80℃保存。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的A260、A280值，計(jì)算其濃度與純度。

2.7PCR擴(kuò)增按照GeXP系統(tǒng)分析原則，設(shè)計(jì)CCND2、CDK4及3個(gè)內(nèi)參TBP、B2M、GADPH的PCR引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。將引物配置成10μmol／L儲(chǔ)存液，按1∶1混合500 nmol／L正向引物和200 nmol／L的反向引物獲得正向與反向引物混合物。依次混合1.5μL的10 ng／μL RNA、1μL反向引物混合物、2μL的5×RT反應(yīng)緩沖液、2.5μL KanR RNA、2.5μL DEPC處理水和0.5μL反轉(zhuǎn)錄酶，混勻后PCR儀上執(zhí)行以下程序：48℃1 min，42℃1 h，95℃5 min，－80℃保存cDNA。取4.3μL的cDNA混入2μL的5×PCR反應(yīng)緩沖液、1μL正向引物混合物、2μL的25 mmol／L的MgCL2和0.7μL Taq酶。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃3 min預(yù)變性，95℃30 s，55℃30 s，70℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)。

2.8GeXP系統(tǒng)分析以DSS 400∶SLS＝0.2∶30混合，混勻后每個(gè)上樣孔分裝30μL的上樣緩沖液，每孔上樣1μL的PCR產(chǎn)物，以礦物油覆蓋。加入250μL的分離液于樣品板對(duì)應(yīng)的分離液板孔中，放置樣品板和分離液板。軟件界面上設(shè)置上樣順序，電泳條件選擇Frag-3，分析方法默認(rèn)，放置膠條后運(yùn)行程序。運(yùn)行完成后，分析結(jié)果，以TBP、B2M、GADPH這3個(gè)內(nèi)參乘積的3次方為內(nèi)參，計(jì)算各組表達(dá)水平。

2.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)用x±s表示，用Excel 2003、SPSS 16.0軟件處理數(shù)據(jù)，組間比較用Student's ttest分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果見表1、表2和圖1。

表1　EESP抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8的細(xì)胞活力

表2　EESP對(duì)CCND2和CDK4表達(dá)水平的影響rfu

4　討論

4.1EESP在0.50 mg／mL和1 mg／mL時(shí)，顯著抑制HCT-8細(xì)胞活力，見表1。hoechst 33258染色發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞核呈現(xiàn)出彌散均勻熒光，而凋亡細(xì)胞則在細(xì)胞核內(nèi)可見濃染致密的顆粒塊狀熒光、染色質(zhì)凝聚等特征，見圖1。與0 mg／mL的EESP組比較，0.25 mg／mL EESP組細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)區(qū)別不大；0.5 mg／mL EESP組細(xì)胞密度變化不明顯，出現(xiàn)個(gè)別凋亡細(xì)胞；1 mg／mL EESP組細(xì)胞密度明顯減少，凋亡細(xì)胞比例較大，說明1 mg／m L的EESP能誘導(dǎo)HCT-8細(xì)胞凋亡。從表1和圖1的結(jié)果看，1 mg／mL的EESP顯著抑制HCT-8細(xì)胞活力且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡特征明顯，故我們?cè)诮Y(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞株中，以該濃度檢測(cè)EESP干預(yù)下HCT-8細(xì)胞中CCND2和CDK4的表達(dá)水平，探討EESP對(duì)HCT-8的細(xì)胞周期相關(guān)基因的影響。

4.2CCND2在EESP干預(yù)下，表達(dá)水平下調(diào)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果顯示EESP抑制CCND2基因表達(dá)，干擾細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖。CCND2是G1／S期特異表達(dá)的Cyclin D2的編碼基因，該蛋白屬于高保守性的細(xì)胞周期素家族，此家族的蛋白被作為標(biāo)志物是因?yàn)樗鼈冊(cè)诩?xì)胞周期的富集程度具有明顯的周期性。作為細(xì)胞周期依賴性激酶的調(diào)節(jié)因子，它們的表達(dá)或降解與細(xì)胞有絲分裂的狀態(tài)密切相關(guān)，由此影響細(xì)胞的增殖［6］。這些細(xì)胞周期素會(huì)組成一個(gè)復(fù)合物，作為CDK4或CDK6的調(diào)控亞基，在細(xì)胞周期G1／S期被激活。研究發(fā)現(xiàn)在EESP干預(yù)下，細(xì)胞周期素D2的基因表達(dá)顯著下調(diào)，但CDK4無顯著性差異，推測(cè)EESP通過抑制細(xì)胞周期素D2的基因，干擾細(xì)胞周期素家族復(fù)合物的形成，從而干擾細(xì)胞周期G1／S期，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞增殖的抑制。

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R284.2

B

1000-338X（2016）05-0011-03

2013-12-24

福建省自然科學(xué)基金資助課題（2014J01360）

方翌（1986—），女，理學(xué)碩士，助理實(shí)驗(yàn)師，主要從事中藥抗腫瘤的作用機(jī)制研究。

彭軍（1969—），男，研究員。Email：pjunlab@hotmail.com