魏小春,李 艷,姚秋菊,原玉香,趙艷艷,王志勇,姜 俊,段俊枝,蔣武生,張曉偉

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所,河南 鄭州 450002;2.駐馬店市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,河南 駐馬店 463000;3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所,河南 鄭州 450002)

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高溫和鹽脅迫下硅對(duì)辣椒CaMADS-box基因表達(dá)的影響

魏小春1,李 艷2,姚秋菊1,原玉香1,趙艷艷1,王志勇1,姜 俊2,段俊枝3,蔣武生1,張曉偉1

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所,河南 鄭州 450002;2.駐馬店市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,河南 駐馬店 463000;3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所,河南 鄭州 450002)

為了探索非生物脅迫下硅對(duì)辣椒CaMADS-box基因表達(dá)的影響,以豫椒101為材料,在對(duì)辣椒CaMADS-box基因片段同源克隆的基礎(chǔ)上,對(duì)其編碼的部分蛋白進(jìn)行氨基酸同源性分析、理化性質(zhì)預(yù)測、亞細(xì)胞定位預(yù)測和進(jìn)化樹分析,探討了硅處理后辣椒CaMADS-box基因在高溫脅迫、鹽脅迫下表達(dá)量的變化,結(jié)果表明,克隆得到的CaMADS-box基因所編碼的蛋白為親水性蛋白,含有MADS結(jié)構(gòu)域,屬于MADS基因家族,亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核中,分子進(jìn)化樹表明其與茄屬和煙草屬親緣關(guān)系最近,相似性達(dá)到67%。熒光定量分析表明,CaMADS-box基因在高溫脅迫和鹽脅迫后表達(dá)量都呈現(xiàn)出先升高后下降的模式,高溫脅迫下48 h達(dá)到峰值,而鹽脅迫在24 h達(dá)到峰值,硅處理能夠誘導(dǎo)CaMADS-box基因表達(dá),在高溫脅迫和鹽脅迫下都在12 h達(dá)到高峰值,這表明CaMADS-box是一個(gè)硅快速響應(yīng)基因,推測硅處理在緩解辣椒高溫脅迫和鹽脅迫等非生物脅迫方面具有重要作用。

硅;辣椒;CaMADS-box基因;非生物脅迫;表達(dá)分析

辣椒(CapsicumannuumL.),是原產(chǎn)于中拉丁美洲熱帶地區(qū)的大眾化蔬菜,在中國的種植面積居世界首位。MADS-box是一個(gè)保守性很強(qiáng)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,由于其最早在酵母MCM1基因、擬南芥AG基因、金魚草DEF基因和人類血清應(yīng)答因子SRF基因中發(fā)現(xiàn),取這4個(gè)基因的首字母縮寫,具有此結(jié)構(gòu)的功能基因被命名為MADS-box基因[1]。MADS-box轉(zhuǎn)錄因子在真核生物中廣泛參與各種重要的生命活動(dòng),比如:生物生長發(fā)育、信號(hào)傳導(dǎo)及抗性調(diào)節(jié)等[2-4]。在植物中除參與花器官發(fā)育與形成的調(diào)節(jié),還參與諸如根和葉的生長、果實(shí)的發(fā)育與成熟和各種脅迫應(yīng)答反應(yīng)等[5-9]。

硅作為植物生長發(fā)育的有益元素,不僅可以促進(jìn)作物生長,而且可以通過提高作物過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等保護(hù)酶的活性來提高作物抗性,緩解鎘、鋁、錳等重金屬對(duì)作物的毒害,最終提高作物的質(zhì)量和產(chǎn)量[10]。目前有關(guān)硅對(duì)辣椒MADS-box轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫下表達(dá)分析的研究還未見報(bào)道。為此,本研究以豫椒101為試驗(yàn)材料,根據(jù)辣椒基因組數(shù)據(jù)庫中MADS-box基因的序列在5′UTR及3′UTR設(shè)計(jì)引物,克隆辣椒CaMADS-box基因,經(jīng)相關(guān)生物信息學(xué)軟件對(duì)其編碼蛋白進(jìn)行序列分析、亞細(xì)胞定位、系統(tǒng)進(jìn)化樹分析和實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)研究,并探討辣椒CaMADS-box轉(zhuǎn)錄因子高溫和鹽脅迫下硅處理對(duì)其表達(dá)的影響,以期闡明該基因的功能,為進(jìn)一步研究硅在緩解辣椒高溫和鹽脅迫方面提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

豫椒101由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所蔬菜育種課題繁育。完全營養(yǎng)液為Hoagland配方?；|(zhì)包含有機(jī)質(zhì)、速效氮、速效鉀、速效磷、有效硅等,含量分別為219.0，1.8，1.7，0.1，53.3 g/kg,pH 值5.5。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 辣椒苗的準(zhǔn)備 供試?yán)苯贩N子用紗布包好,先在55 ℃的熱水中溫湯浸種20 min,然后室溫條件下充分吸水6～8 h,播于營養(yǎng)缽(6 cm×8 cm),每穴1～2粒種子。待子葉出土即放于光照強(qiáng)度為300～600 μmol/(m2·s)的人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng),生長溫度控制在25 ℃/18 ℃(晝/夜) 。出苗后澆1/2 營養(yǎng)液,每缽留壯苗1棵,長至4葉1心時(shí)轉(zhuǎn)苗至大營養(yǎng)缽(10 cm×10 cm)。當(dāng)幼苗第5片真葉展開時(shí)移入人工氣候箱進(jìn)行處理。1.2.2 材料處理 高溫脅迫處理:當(dāng)植株6～8片真葉展平時(shí),將穴盤放入預(yù)先升溫到45 ℃的光照培養(yǎng)箱內(nèi)(光照強(qiáng)度為160 μmol/(m2·s))進(jìn)行高溫處理。高溫處理方法如下,定植8 d 后,置于溫度為(45±2)℃(晝)/(35±2)℃(夜)、光強(qiáng)為60 mmol/(m2·s)、光周期為12 h/12 h的培養(yǎng)箱進(jìn)行高溫處理。高溫脅迫下的硅處理:高溫脅迫處理同上,設(shè)置1 CK(不加硅、不高溫處理);2 高溫,(45±2)℃(晝)/(35±2)℃(夜);3 加硅、加高溫(K2SiO31.5 mmol/L+(45±2)℃(晝)/(35±2)℃(夜)) 3 個(gè)處理,每個(gè)處理重復(fù)3次,每個(gè)重復(fù)9 株。不加硅處理中加入1.0 mmol/L的K2SO4溶液,以平衡鉀離子。鹽脅迫處理:當(dāng)植株6～8片真葉展平時(shí),設(shè)置1 CK(不加氯化鈉);2 加氯化鈉(NaCl 150 mmol/L)2個(gè)處理,每個(gè)處理重復(fù)3次,每個(gè)重復(fù)9 株。鹽脅迫下的硅處理:鹽脅迫處理同上,設(shè)置1 CK(不加硅不加氯化鈉);2 加氯化鈉(NaCl 150 mmol/L);3 加硅加氯化鈉(K2SiO31.5mmol/L+NaCl 150 mmol/L) 3 個(gè)處理,每個(gè)處理重復(fù)3次,每個(gè)重復(fù)9 株。不加硅處理中加入1.0 mmol/L的K2SO4溶液,以平衡鉀離子。

每處理27株,處理時(shí)間為0，6，12，24，48，96 h。未處理材料為對(duì)照。取樣后立即浸入液氮中,并放入-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2.3 辣椒總RNA提取和cDNA合成 總RNA的提取采用TRIzol法(USA)。

cDNA合成采用Thermo Scientific公司cDNA合成試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit。

1.2.4MADS-box基因cDNA全長克隆 根據(jù)辣椒基因組數(shù)據(jù)庫(http://peppergenome.snu.ac.kr/)中MADS-box基因(CA08g07400)的序列在5′UTR及3′UTR設(shè)計(jì)引物(表1),委托Invitrogen生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以cDNA第1鏈為模板,用MADS-box基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min,共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

表1 引物序列信息

PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收,回收片段與PMD19-T載體(TaKaRa公司)連接,熱擊法轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,挑選陽性單克隆送公司測序,得到目的片段序列。Marker DL2000購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 序列分析

利用ClustalX2 軟件對(duì)克隆的CaMADS-Box基因的核苷酸和氨基酸序列與其他物種的對(duì)應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)分析;根據(jù)所得的cDNA序列,對(duì)基因所編碼的氨基酸蛋白進(jìn)行同源序列比對(duì),并結(jié)合MEGA 4.0構(gòu)建進(jìn)化樹;利用軟件ProtParam(/)對(duì)CaMADS-Box基因編碼的氨基酸組分、分子量和等電點(diǎn)進(jìn)行分析;利用軟件ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)分析氨基酸序列的親/疏水性;利用軟件SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測;利用軟件BaCelLo(http://gpcr2.biocomp.unibo.it/bacello/pred.htm)進(jìn)行亞細(xì)胞定位的預(yù)測。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量分析

對(duì)各個(gè)處理后的辣椒葉片提取總RNA,并反轉(zhuǎn)錄為第1鏈cDNA(TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser)。儀器為羅氏公司LightCycler? 96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。反應(yīng)體系為20.0 μL,含有10.0 μL 2×SYBR? Premix ExTaqTM(Tli RNaseH Plus),2.0 μL cDNA,上下游引物(q-MADS-boxF及q-MADS-boxR)各1 μL(引物濃度10 μmol/L)(表1),6 μL ddH2O。運(yùn)行程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s,40 次循環(huán)；72 ℃延伸60 s。每個(gè)樣品3 次重復(fù)。

以Actin基因?yàn)閮?nèi)參,引物用cACTINF228和cACTINR384;MADS-box基因片段為目的片段,擴(kuò)增引物為qMADSF166和qMADSR364。采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒CaMADS-box基因的克隆

以辣椒cDNA第1條鏈為模板,用引物MADS-box-F/MADS-box-R擴(kuò)增出700 bp左右的目的片段(圖1),將目的片段回收后連接轉(zhuǎn)化,挑取陽性克隆用引物檢測后測序。測序結(jié)果顯示該片段與辣椒基因組數(shù)據(jù)庫中目的片段完全一致,大小為690 bp,該基因從起始密碼ATG到終止密碼TAG具有一個(gè)完整的ORF為444 bp,編碼147個(gè)氨基酸,命名為CaMADS-box。

M.DL2000。

2.2 辣椒CaMADS-box基因氨基酸序列同源性分析

辣椒CaMADS-box基因所編碼的蛋白質(zhì)中含有MADS基因家族保守結(jié)構(gòu)域之一MADS區(qū)。應(yīng)用Clustalx-2.1軟件進(jìn)行多重比對(duì),將辣椒CaMADS-box基因編碼的氨基酸序列與其他物種的MADS-box基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。比對(duì)結(jié)果表明,辣椒CaMADS-box氨基酸與其他作物MADS-box氨基酸有高度的相似性,屬于MADS-box家族(圖2)。

2.3 辣椒CaMADS-box蛋白理化性質(zhì)的預(yù)測

利用軟件預(yù)測辣椒CaMADS-box氨基酸的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為16.634 kDa,理論等電點(diǎn)為5.16,分子式為C720H1177N201O235S7。該蛋白質(zhì)中含量最高的氨基酸為Glu,相對(duì)含量達(dá)到了14.3%,含量較低的氨基酸有Cys和Tyr,含量僅為0.7%,不含有Pyl、Trp和Sec。其脂肪系數(shù)為71.56,其疏水性平均值為-0.727,說明該蛋白為親水性蛋白。

2.4 辣椒CaMADS-box蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測

利用BaCelLo軟件對(duì)辣椒CaMADS-box氨基酸進(jìn)行亞細(xì)胞定位的預(yù)測,結(jié)果表明其定位在細(xì)胞核中(圖3)。

圖2 辣椒CaMADS-box氨基酸序列與其他作物MADS-box氨基酸序列比對(duì)

圖3 辣椒CaMADS-box蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測

蛋白質(zhì)的多肽鏈通過折疊、螺旋、卷曲等二級(jí)結(jié)構(gòu)的作用形成比較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu),利用軟件分析MADS-box的二級(jí)結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)多個(gè)氨基酸參與α-螺旋、無規(guī)則卷曲和延伸鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu),其中α-螺旋、延伸鏈、β-折疊和無規(guī)則卷曲分別占50.34%,17.69%,4.08%,27.89%(圖4)。這4個(gè)結(jié)構(gòu)是構(gòu)成MADS-box蛋白的基本結(jié)構(gòu)。

h.α-螺旋；e.延伸鏈；t.β-折疊；c.無規(guī)則卷曲。

采用ProtScale 對(duì)MADS-box蛋白質(zhì)的疏水性進(jìn)行分析(圖5),整體來看,親水性氨基酸和疏水性氨基酸在整個(gè)蛋白質(zhì)中分布均勻,無明顯的疏水區(qū)。

2.5 辣椒CaMADS-box蛋白進(jìn)化樹分析

使用NCBI中BlastP工具對(duì)辣椒CaMADS-box氨基酸序列進(jìn)行同源性檢索,對(duì)檢索到的數(shù)據(jù)再利用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明,辣椒CaMADS-box與茄屬和煙草屬親緣關(guān)系最近,相似性達(dá)到67%。而與葡萄屬及大豆等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖6)。

圖5 辣椒CaMADS-box氨基酸疏水性預(yù)測

2.6 辣椒CaMADS-box基因在非生物脅迫下的表達(dá)分析

表達(dá)分析表明,CaMADS-box基因在高溫脅迫后表達(dá)量逐漸升高后下降,在6 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到6.5倍,48 h時(shí)達(dá)到峰值,為對(duì)照的12.6倍(圖7-A);高溫脅迫下,CaMADS-box基因在硅處理0 h較高,6 h時(shí)表達(dá)量降低,在12 h時(shí)回升,隨后隨著處理時(shí)間的延長后逐漸降低(圖7-B);CaMADS-box基因在鹽脅迫后表達(dá)量逐漸升高后下降,在6 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到2.5倍,24 h時(shí)達(dá)到峰值,為對(duì)照的3.9倍(圖7-C);鹽脅迫下,CaMADS-box基因在硅處理6 h后表達(dá)量緩慢降低,在12 h時(shí)迅速升高達(dá)到峰值,為對(duì)照的5.8倍,24 h后迅速恢復(fù)正常(圖7-D)。

圖6 辣椒及其他物種MADS-box蛋白進(jìn)化樹分析

3 結(jié)論和討論

植物MADS-box基因在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用,迄今為止,已經(jīng)在植物中發(fā)現(xiàn)數(shù)以百計(jì)的MADS-box基因,該基因通過與其他基因相互作用形成蛋白二聚體或者多聚復(fù)合物,進(jìn)而調(diào)控植物的生長發(fā)育。

本研究對(duì)克隆得到的CaMADS-box基因進(jìn)行分析,結(jié)果表明,其編碼蛋白為親水性蛋白,含有MADS結(jié)構(gòu)域,屬于MADS基因家族,亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核中,分子進(jìn)化樹表明與茄屬和煙草屬親緣關(guān)系最近。熒光定量分析表明,CaMADS-box基因在高溫脅迫和鹽脅迫后表達(dá)量都呈現(xiàn)出先升高后下降的模式,不同的是高溫脅迫下48 h時(shí)達(dá)到峰值,而鹽脅迫在24 h時(shí)達(dá)到峰值,硅處理能夠誘導(dǎo)CaMADS-box基因表達(dá),在高溫脅迫和鹽脅迫下都在12 h到達(dá)表達(dá)高峰。

植物MADS-box基因功能的研究,在最開始主要集中在對(duì)花器官形成的作用上,例如:花器官從營養(yǎng)到生殖生長過程的轉(zhuǎn)換，其對(duì)光周期的敏感性、開花時(shí)間、花粉的發(fā)育等[12-15]。研究結(jié)果表明,MADS-box轉(zhuǎn)錄因子除對(duì)花器官具有調(diào)節(jié)作用外,還廣泛參與植物生長發(fā)育的各個(gè)方面,如頂端分生組織的分化、根的生長發(fā)育、果實(shí)的發(fā)育、光合作用和營養(yǎng)代謝、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及響應(yīng)脅迫應(yīng)答等[16-21]。

A.高溫脅迫處理;B.高溫脅迫下的硅處理;C.鹽脅迫處理;D.鹽脅迫下的硅處理。

研究表明,在鹽脅迫及甘露醇脅迫下,玉米ZmMADS-box基因明顯呈現(xiàn)上調(diào)趨勢[22]。對(duì)水稻花期MADS-box基因研究表明，熱處理(35～39 ℃)下，OsMADS87基因變化明顯，進(jìn)一步研究表明該基因與胚發(fā)育及種子大小有關(guān)[23]。對(duì)大白菜高豐度表達(dá)的BrMADS-box基因進(jìn)行干旱及鹽脅迫處理后發(fā)現(xiàn),分別有8，6個(gè)BrMADS-box基因上調(diào)[24]。這說明MADS-box基因不僅在植物花發(fā)育過程中起著重要作用,在逆境脅迫中相應(yīng)也發(fā)揮作用。

硅是植物生長的有益元素,特別是它在植物遭受非生物脅迫和生物脅迫時(shí)起重要的抗性或?qū)δ婢车木徑庾饔?。目?有關(guān)硅在植物遭受非生物脅迫時(shí)對(duì)MADS-box基因表達(dá)變化的研究還比較少。本研究通過辣椒CaMADS-box基因遭受高溫脅迫和鹽脅迫的熒光定量分析發(fā)現(xiàn),CaMADS-box基因在高溫脅迫和鹽脅迫后表達(dá)量都呈現(xiàn)出先升高后下降的模式,硅處理能夠誘導(dǎo)CaMADS-box基因提前到達(dá)表達(dá)高峰,這表明CaMADS-box是一個(gè)硅快速響應(yīng)基因,辣椒硅處理在緩解辣椒高溫脅迫和鹽脅迫等非生物脅迫方面具有重要作用。

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The Effect of Silicon on PepperCaMADS-boxGene Expression under Heat and Salt Stress Analysis

WEI Xiaochun1,LI Yan2,YAO Qiuju1,YUAN Yuxiang1,ZHAO Yanyan1,WANG Zhiyong1,JIANG Jun2,DUAN Junzhi3,JIANG Wusheng1,ZHANG Xiaowei1

(1.Institute of Horticulture,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China;2.Zhu ma dian Institute of Agricultural Sciences,Zhumadian 463000,China;3.Institute of Agricultural Economy and Information,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China)

In order to study the influence of silicon on the expression of pepperCaMADS-boxgene under abiotic stress,such as the high temperature and salt stress,we used pepper 101 as experimental materials,the physical and chemical properties of encoding protein was analyzed,phylogenetic tree was constructed,subcellular localization was predicted through bioinformatics software on the base of the cloning of pepperCaMADS-boxgene.The results showed that the cloned gene encoding protein CaMADS-box was hydrophilic protein,containing MADS domain structure,belonged to MADS gene families.And its subcellular localization was in the nucleus,the molecular evolutionary tree showed that close to Nicotiana,the similarity was 67%.Fluorescence quantitative analysis showed thatCaMADS-boxgene expression after high temperature stress and salt stress were presented first rise after the fall of the model, the difference was to peak at 48 h, under high temperature stress, salt stress peak at 24 h, silicon handle could induce gene expressionCaMADS-box, under high temperature stress and salt stress were expressed at 12 h to reach peak, which suggested thatCaMADS-boxwas a silicon quick response genes, speculated that the silicon handle in alleviating pepper abiotic stress such as high temperature and salt stress plays an important role.

Silicon;CapsicumannuumL.;CaMADS-boxgene;Abiotic stress;Expression analysis

2016-07-08

國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系豫北綜合試驗(yàn)站項(xiàng)目(CARS-25-G-27)；農(nóng)業(yè)部黃淮地區(qū)(河南)蔬菜科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站(10205020)；河南省重大科技專項(xiàng)(151100110400)

魏小春(1983-),男,河南項(xiàng)城人,助理研究員,博士,主要從事植物生理與分子生物學(xué)研究。

張曉偉(1965-),男,河南平輿人,研究員,碩士，主要從事蔬菜育種與分子生物學(xué)研究。

Q78

A

1000-7091(2016)05-0007-07

10.7668/hbnxb.2016.05.002