鄧培淵,袁 偉,李玉華,王林青,李長看

(1.鄭州師范學(xué)院 生物物種資源研究中心,河南 鄭州 450044;2.華北水利水電大學(xué) 環(huán)境與市政工程學(xué)院,河南 鄭州 450045)

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小菜蛾觸角結(jié)合蛋白PxylABP結(jié)合模式的研究

鄧培淵1,袁 偉2,李玉華1,王林青1,李長看1

(1.鄭州師范學(xué)院 生物物種資源研究中心,河南 鄭州 450044;2.華北水利水電大學(xué) 環(huán)境與市政工程學(xué)院,河南 鄭州 450045)

為了研究觸角結(jié)合蛋白(Antennal binding proteins,ABPs)的生理功能,利用RT-PCR方法克隆了小菜蛾P(guān)xylABP基因,并在大腸桿菌中表達,純化的重組蛋白通過熒光競爭結(jié)合試驗測定其與29種化合物的結(jié)合特性,并運用AutoDock 4.2進行PxylABP蛋白和化合物的分子對接。結(jié)果表明,PxylABP與異硫氰酸丙烯酯、己醛、己烷、2-己酮、吲哚和β-紫羅蘭酮結(jié)合,解離常數(shù)分別為0.91,1.81,1.17,2.71,2.74,14.95 μmol/L;分子對接顯示,Tyr100與異硫氰酸丙烯酯形成1個氫鍵。說明PxylABP參與了小菜蛾識別十字花科蔬菜和蟲害誘導(dǎo)的植物揮發(fā)物的生理過程。

小菜蛾;觸角結(jié)合蛋白;熒光競爭結(jié)合試驗;分子對接

小菜蛾(PlutellaxylostellaL.)屬鱗翅目(Lepidoptera)菜蛾科(Plutellidae),主要危害十字花科蔬菜,已經(jīng)成為十字花科蔬菜上的第一大害蟲[1],在全國各地均有危害記錄,在南方的危害尤為嚴(yán)重,且對田間常用殺蟲劑產(chǎn)生了較強抗藥性[2];常規(guī)的化學(xué)防治效果較差,而且蔬菜害蟲的防治對殺蟲劑的毒性和殘留要求嚴(yán)格,因此,有必要尋找一種更安全、高效的防治策略。

利用氣味影響昆蟲的嗅覺行為是取代化學(xué)殺蟲劑的有效途徑[3],嗅覺對昆蟲尋找寄主植物、配偶和產(chǎn)卵場所等活動起重要作用,基于嗅覺調(diào)控的性誘劑在害蟲防治中得到了廣泛應(yīng)用[4-5],對昆蟲嗅覺感受機制的研究是探索此類防治方法的關(guān)鍵。氣味結(jié)合蛋白(Odorant binding proteins,OBPs)是一類低分子質(zhì)量水溶性酸性蛋白,溶解并運輸脂溶性的化合物分子穿過親水性的淋巴液嗅覺神經(jīng)樹突末梢[6],在昆蟲的嗅覺行為中起重要作用,OBPs可分為性信息素結(jié)合蛋白(Pheromone binding proteins,PBPs)、普通氣味結(jié)合蛋白(General odorant binding proteins,GOBPs)和觸角結(jié)合蛋白(Antennal binding proteins,ABPs)[7]3個亞類,ABPs在觸角中特異表達,具有氣味結(jié)合蛋白的典型特征,但與PBPs和GOBPs同源性較低[8],目前已在家蠶(Bombyxmori)[7]、棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)[9]和煙蚜夜蛾(Heliothisvirescens)[10]等鱗翅目昆蟲中克隆到ABPs基因,通過分析ABPs的組織分布和結(jié)構(gòu)特性,推測其在昆蟲氣味識別中的作用,但對其生理功能的研究較少。因此,本試驗利用RT-PCR方法克隆小菜蛾P(guān)xylABP基因,并在大腸桿菌中表達,純化后進行熒光競爭結(jié)合試驗,參照Li等[11]和Qiao等[12]的方法,測定PxylABP蛋白與主要綠色植物揮發(fā)物[13]和蟲害誘導(dǎo)植物揮發(fā)物[14]的結(jié)合特性;此外,運用同源建模方法構(gòu)建PxylABP蛋白三維結(jié)構(gòu),以結(jié)合能力最強的外源配基為配體,采用AutoDock分子對接技術(shù)分析PxylABP蛋白與配體的作用方式,確定其結(jié)合的關(guān)鍵位點和氨基酸。旨在為闡明PxylABP的生理功能和作用機制提供理論依據(jù),也為深入了解小菜蛾的氣味感受機制,從而利用其控制蟲害提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 生物材料

小菜蛾采集自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū),幼蟲用蘿卜苗飼養(yǎng),溫度26 ℃,相對濕度為70%～80%,光周期L∶D=16∶8。

1.2 主要試劑和儀器

NdeⅠ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶、rTaqDNA聚合酶、T4 ligase連接酶、MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit、IPTG和低分子質(zhì)量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品購自TaKaRa公司;熒光探針1-NPN和外源氣味分子化合物為Sigma公司產(chǎn)品;DE-52為Whatman產(chǎn)品；AKTA蛋白純化系統(tǒng)和分子篩Superose-12預(yù)裝柱為GE公司產(chǎn)品；熒光分光光度計為Jasco FP-750;表達載體pET-30b(+)、菌株DH10B和BL21(DE3)為鄭州市生物物種資源研究重點實驗室保存。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3PxylABP基因的克隆、表達和純化

1.3.1 引物的設(shè)計與合成 從GenBank查取PxylABP(ID:AB189031.1)的CDS序列,運用在線軟件http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/預(yù)測其信號肽序列,除去后依據(jù)其成熟編碼區(qū)序列設(shè)計引物如下:

PxylABP-Forward(5′-3′):ATCATATGCTCACAG ACGAGCA

PxylABP-Reverse(5′-3′):GCGAATTCTTACAGG AAGATG

下劃線為酶切位點(NdeⅠ和EcoRⅠ)序列,酶切位點前為保護堿基。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3.2 小菜蛾觸角總RNA的提取和cDNA的合成 取小菜蛾成蟲觸角50對,DEPC水處理后按試劑盒說明書提取總RNA和合成第1條鏈cDNA。1.3.3PxylABP基因的克隆與其在大腸桿菌中的表達 取cDNA 50 ng,建立20 μL反應(yīng)體系:2 μL 10×PCR Buffer,1.6 μL dNTP Mix,0.2 μL rTaq酶,正、反引物各1 μL(10 μmol/L),ddH2O補至20 μL。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,共30個循環(huán);72 ℃終延伸10 min,以ddH2O替代cDNA作空白對照。

PCR產(chǎn)物和pET-30b(+)經(jīng)Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切后連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH10B,經(jīng)菌液PCR和驗證測序得到重組表達載體pET/30b-PxylABP,將重組表達載體轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,挑單克隆37 ℃于LB(Kan質(zhì)量濃度10 μg/mL)中過夜培養(yǎng),以1∶100(V∶V)加入到新鮮LB(含抗生素)中,培養(yǎng)至OD600值為0.8時加入IPTG(終濃度為1 mmol/L),誘導(dǎo)5 h,SDS-PAGE電泳檢測。

1.3.4 重組PxylABP蛋白的純化 用1 000 mL LB培養(yǎng)基大量表達pET/30b-PxylABP,檢測重組蛋白表達形式(包涵體或者可溶性)后,經(jīng)陰離子交換樹脂(DE-52)和分子篩(Superose-12)進行純化。

1.4 熒光競爭結(jié)合試驗

1.4.1 PxylABP蛋白與1-NPN解離常數(shù)的測定 設(shè)定激發(fā)光波長為337 nm,掃描波長350～500 nm,在2 μmol/L PxylABP蛋白中依次加入2～16 μmol/L的1-NPN,反應(yīng)2 min,熒光強度穩(wěn)定后記錄峰值的紅移和強度變化數(shù)據(jù)。

1.4.2 配體與PxylABP蛋白解離常數(shù)的測定 在2 μmol/L PxylABP蛋白中加入4 μmol/L的1-NPN,放置2 min,加入不同濃度的外源配體(表1),掃描發(fā)射波長350～500 nm,熒光強度穩(wěn)定后記錄強度值。所得數(shù)據(jù)均為3次數(shù)據(jù)的平均值。

表1 不同配基和PxylABP蛋白的IC50值和解離常數(shù)K

注:當(dāng)外源配基濃度達到20 μmol/L時熒光強度未降至50%,則IC50和K值標(biāo)記為空白。

Note：If the flurorescence intensity has no obvious change when external ligand concentrations reach 40 μmol/L，the IC50and K was recorded as blank.

1.4.3 數(shù)據(jù)分析 運用GraphPad Prism 5軟件測定蛋白與1-NPN的解離常數(shù)K1-NPN;運用SPSS Statistics 17.0軟件測定配基IC50值。

假定蛋白的活性為100%,飽和狀態(tài)下與配基結(jié)合的比例是1∶1,根據(jù)IC50值計算競爭配基的解離常數(shù)K=IC50/(1+[1-NPN]/K[1-NPN])

1.5 PxylABP與配體的分子對接分析

1.5.1 PxylABP和配體三維模型的構(gòu)建 小菜蛾P(guān)xylABP三維模型運用Easy Modeller 4.0中同源建模程序包構(gòu)建,主要包括從蛋白質(zhì)晶體數(shù)據(jù)庫(www.rcsb.org)中搜索同源蛋白,將目標(biāo)蛋白序列與模板蛋白序列對比,建立模型及對模型的優(yōu)化和評估等。

依據(jù)熒光競爭結(jié)合試驗結(jié)果選取結(jié)合能力最強的化合物并構(gòu)建其結(jié)構(gòu)。運用ChemBio Office 10.0程序包中ChemBioDraw模塊構(gòu)建配基初始結(jié)構(gòu),再運用ChemBio3D模塊構(gòu)建其空間結(jié)構(gòu)并進行能量最小化優(yōu)化。

1.5.2 PxylABP與配體的分子對接 運用分子對接軟件AutoDock 4.2進行PxylABP蛋白與配體的分子對接,選擇經(jīng)驗自由能函數(shù)和拉馬克遺傳算法(LGA)計算PxylABP與配體的可能構(gòu)象,對接過程中PxylABP蛋白保持剛性結(jié)構(gòu),配體設(shè)為全柔性結(jié)構(gòu)(所有可旋轉(zhuǎn)鍵自由旋轉(zhuǎn)),保留對接復(fù)合物的10個構(gòu)象,最后選取自由能最低的構(gòu)象進行分析[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1PxylABP基因的克隆和表達載體構(gòu)建

以小菜蛾觸角第1條鏈cDNA為模板,擴增PxylABP基因,結(jié)果如圖1所示,PxylABP與pET-30b(+)雙酶切后連接,連接結(jié)果經(jīng)測序驗證表達載體pET/30b-PxylABP構(gòu)建成功。

M.標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量DL2000；1.空白對照；2.PxylABP基因擴增結(jié)果。

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);1.誘導(dǎo)的pET-30b(+);2.誘導(dǎo)的pET/30b-PxylABP;3.離子交換層析結(jié)果;4.分子篩純化結(jié)果。

M.Protein molecular weight Marker;1.Induced pET-30b(+);2.Induced pET/30b-PxylABP;3.Product of ion exchange chromatography;4.Product of molecular sieve purification.

圖2 PxylABP蛋白表達、純化的SDS-PAGE分析

Fig.2 SDS-PAGE analysis of expression and purification of PxylABP portein

2.2 pET/30b-PxylABP的表達和重組蛋白的純化

pET/30b-PxylABP經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,經(jīng)檢測在14.3 kDa附近有1條特異性條帶出現(xiàn)(圖2泳道2),而經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET-30b(+)無此條帶(圖2泳道1),表明PxylABP基因在BL21(DE3)中正確表達。

大量表達的重組PxylABP蛋白經(jīng)檢測以可溶性形式存在于上清液中,上清液經(jīng)濃縮后經(jīng)陰離子交換層析(DE-52)(圖2泳道3)和分子篩(Superose-12)(圖2泳道4)純化,分離到重組PxylABP蛋白經(jīng)檢測無明顯雜帶,說明重組蛋白純度較高。

2.3 熒光競爭結(jié)合試驗結(jié)果的統(tǒng)計分析

337 nm的發(fā)射光激發(fā)PxylABP蛋白與1-NPN混合物,掃描350～500 nm波長,在407 nm處出現(xiàn)波峰,峰值增強。

在2 μmol/L PxylABP蛋白中逐步加入1-NPN,使其濃度達到0～16 μmol/L,熒光強度逐步增加(圖3),PxylABP蛋白與1-NPN的K1-NPN為2.74 μmol/L;測定與29種外源化合物的結(jié)合能力結(jié)果如圖4和表1所示:異硫氰酸丙烯酯結(jié)合能力最強,解離常數(shù)K為0.91 μmol/L,己醛、己烷、2-己酮和吲哚次之,解離常數(shù)分別為1.81，1.17，2.71，2.74 μmol/L,β-紫羅蘭酮最低,K為14.95 μmol/L;其他化合物在濃度達到20 μmol/L時熒光強度沒有明顯的降低。

圖3 PxylABP蛋白與1-NPN結(jié)合曲線

2.4 PxylABP蛋白三維模型構(gòu)建和其與配體分子對接結(jié)果分析

運用DS 2.5軟件對PxylABP進行同源搜索,發(fā)現(xiàn)1個與目的蛋白序列相似性較高的模板,晶體庫登錄號及相似度分別為1C3Y和32%,構(gòu)建模型(圖5-A中螺旋狀結(jié)構(gòu))Verify Score為44.43接近于Verify Expected High Score值(48.20),Ramachandran Plot圖顯示氨基酸均在最適區(qū)域,說明模型質(zhì)量較高,經(jīng)動力學(xué)優(yōu)化后保存模型。

圖4 配基與PxylABP蛋白的競爭結(jié)合曲線

由于無資料顯示小菜蛾P(guān)xylABP可能的活性位點,所以在用AutoDock 4.2程序進行分子對接時,設(shè)置Grid Box分子對接格點涵蓋整個模型,對接體系分子對接格點分別為124×94×84,格點間距為3.75 nm,結(jié)合模式如圖5所示:配體對接后處于PxylABP結(jié)合腔內(nèi)。

圖5-B為PxylABP和異硫氰酸丙烯酯對接相互作用的二維圖,由圖5可見:PxylABP和異硫氰酸丙烯酯作用有1個氫鍵形成(虛線),受體為Tyr 100∶O,配體為N,鍵長為0.31 nm。可見氨基酸殘基Tyr100在PxylABP和異硫氰酸丙烯酯結(jié)合的穩(wěn)定性方面具有重要作用。

Helical structure depicts receptor and barred structure depicts ligand in A.

3 結(jié)論與討論

特異性結(jié)合外界脂溶性氣味分子是OBPs重要的功能之一。目前主要運用熒光結(jié)合試驗來測定OBPs與氣味分子的結(jié)合特性,已成功運用于果蠅[16]、家蠶[17]、二化螟[18]、豌豆蚜(Acyrthosiphoupisum)[19]、埃及伊蚊(Aedesaegypti)[11]和苜蓿盲蝽(Adelphocorislineolutus)[20]等多種昆蟲OBPs和氣味分子的結(jié)合試驗中,本試驗測定了小菜蛾P(guān)xylABP與部分綠葉植物揮發(fā)物和植物蟲害誘導(dǎo)揮發(fā)物的結(jié)合特性,發(fā)現(xiàn)PxylABP與蟲害誘導(dǎo)揮發(fā)物有較強的結(jié)合能力,一般認(rèn)為蟲害誘導(dǎo)的揮發(fā)物對捕食性或寄生性天敵具有較強的引誘作用[21-22],說明PxylABP在小菜蛾逃避天敵行為方面具有一定的作用;試驗還發(fā)現(xiàn)PxylABP對普通的綠葉植物揮發(fā)物均不結(jié)合,但對十字花科蔬菜特有的氣味物質(zhì)-異硫氰酸丙烯酯結(jié)合能力最強,但也有研究表明異硫氰酸丙烯酯是蟲害誘導(dǎo)的產(chǎn)物,正常十字花科植物并不含有此類物質(zhì)[23-24];此外還發(fā)現(xiàn)β-紫羅蘭酮與PxylABP有微弱的結(jié)合力,與之前的研究是一致的[25]。由上述研究可知,PxylABP以某種方式參與了小菜蛾特異的尋找十字花科寄主和感受蟲害誘導(dǎo)物的行為。

PxylABP與異硫氰酸丙烯酯的分子對接結(jié)果顯示,異硫氰酸丙烯酯結(jié)合于PxylABP疏水性腔內(nèi),對接復(fù)合物中有1個氫鍵形成,氫鍵具有穩(wěn)定性、方向性和飽和性,分子間生成氫鍵可以降低物質(zhì)的能量,增強化合物穩(wěn)定性[26],由此推測氨基酸Tyr100在PxylABP識別異硫氰酸丙烯酯過程中具有重要作用,但更精細(xì)的研究如結(jié)合力中范德華力、靜電力溶劑化能等的作用和角色還需經(jīng)分子動力學(xué)模擬的方法進一步研究。

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Study on Binding Pattern of Antennal Binding Protein PxylABP inPlutellaxylostella

DENG Peiyuan1,YUAN Wei2,LI Yuhua1,WANG Linqing1,LI Changkan1

(1.Biological Species Resource Research Center,Zhengzhou Normal University,Zhengzhou 450044,China;2.School of Environmental and Municipal Engineering,North China University of Water Resources and Electric Power,Zhengzhou 450045,China)

Antennal binding proteins are soluble acidic proteins in insect antenna.It is an important way to clarify ABP physiological function by analysising the binding pattern.ThePxylABPgene ofPlutellaxylostellawas cloned using reverse transcription PCR and expressed inEscherichiacoli.The specificity of PxylABP binding with 29 compounds was tested through fluorescence competitive binding assay,and the molecular docking of PxylABP with compounds were carried out using AutoDock 4.2.The results showed that PxylABP protein had binding ability to Allylisothiocyanate,Hexane,Hexanal,Indole,2-hexanone and β-Lonone,with the dissociation constants of 0.91,1.81,1.17,2.71,2.74 and 14.95 μmol/L,respcetively;The molecular docking results showed that one hydrogen bond generated between Tyr100 and Allyl-isothiocyanate.These data suggested that PxylABP might be involved in the physiological process that discriminate the cruciferous vegetables and herbivore-induced plant volatiles inPlutellaxylostella.

Plutellaxylostella;Antennal binding proteins;Fluorescence competitive binding assay;Molecular docking

2016-07-09

河南省科技攻關(guān)重點項目(132102110175)

鄧培淵(1981-),男,河南登封人,講師,博士,主要從事昆蟲分子生物學(xué)研究。

李長看(1967-)，男，河南登封人，教授，主要從事動物生態(tài)學(xué)研究。

Q78

A

1000-7091(2016)05-0233-06

10.7668/hbnxb.2016.05.036