郝曜山,張歡歡,杜建中,王亦學(xué),孫 毅

(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究中心,山西 太原 030031)

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轉(zhuǎn)水稻OsSIK1基因玉米植株的獲得及抗旱性分析

郝曜山,張歡歡,杜建中,王亦學(xué),孫 毅

(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究中心,山西 太原 030031)

類受體激酶基因OsSIK1具有通過激活抗氧化系統(tǒng),增強(qiáng)水稻對于干旱和鹽脅迫抗性的作用。為了豐富可利用的作物抗旱基因,獲得具有較高抗旱水平的玉米新種質(zhì),通過超聲波輔助花粉介導(dǎo)法,將水稻類受體激酶基因OsSIK1導(dǎo)入玉米自交系鄭58中,并對轉(zhuǎn)化株進(jìn)行卡那霉素篩選及T1、T2、T3的PCR及Southern Blotting雜交等分子檢測,獲得轉(zhuǎn)化植株并在T3獲得轉(zhuǎn)基因純合株系。對T3轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米對照以16.1%的PEG模擬水分脅迫進(jìn)行抗旱性分析。結(jié)果表明,與對照相比,在水分脅迫處理下,轉(zhuǎn)基因玉米株系葉片相對含水量提高了7.4%～19.8%，葉綠素含量提高了11.3%～106.9%，SOD活性上升45.8%～93.4%,而轉(zhuǎn)基因玉米葉片的相對電導(dǎo)率下降了35.4%～58.1%，MDA含量下降了25.7%～50.4%,說明轉(zhuǎn)OsSIK1基因玉米植株抗旱性得到提高,其中,5個轉(zhuǎn)化株系與對照在抗旱性方面有顯著差異,且生長狀況明顯優(yōu)于對照。綜上所述,研究最終獲得5個轉(zhuǎn)OsSIK1基因玉米株系,并證明導(dǎo)入水稻OsSIK1基因可以提高玉米植株的抗旱性。

OsSIK1基因;花粉介導(dǎo)轉(zhuǎn)化;轉(zhuǎn)基因玉米;抗旱性

我國是世界第二大玉米生產(chǎn)國,2015年玉米種植面積3 811萬hm2,總產(chǎn)2.25億t[1];同時,我國也是玉米的消費(fèi)大國,其作為飼料、糧食和工業(yè)原料的需求量正在迅速增長,玉米消費(fèi)量從2001年的1.14億t上升至2014年的1.97億t[2]。然而,在我國,干旱這個普遍存在的非生物脅迫原因卻成為制約玉米產(chǎn)量的重要因素之一,旱災(zāi)面積約占全年成災(zāi)面積的50%[3],對國家玉米的安全生產(chǎn)威脅極大。因此,培育抗旱的玉米新品種十分重要。但玉米的抗旱性狀是多基因控制的數(shù)量性狀,生產(chǎn)上可利用的抗旱種質(zhì)資源相對匱乏[4-5]。因此,玉米抗旱育種一直以來研究進(jìn)展相對緩慢。

目前,隨著植物抗旱生理生化和分子機(jī)制研究的不斷突破,有關(guān)學(xué)者確定了一部分與抗旱有關(guān)的重要基因,通過轉(zhuǎn)基因方法導(dǎo)入抗旱基因,已成為增強(qiáng)玉米抗旱性、獲得抗旱新種質(zhì)的重要途徑[6]。Liu等[7]使玉米磷脂酰肌醇合成酶基因在玉米中進(jìn)行過表達(dá),結(jié)果表明,干旱處理后玉米體內(nèi)的磷脂和半乳糖脂含量顯著增加,使得轉(zhuǎn)基因玉米的抗旱性顯著高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?石薇等[8]將ZmPti1、ZmPti1-1、ZmCIPK2 這3種蛋白激酶基因植物表達(dá)載體分別導(dǎo)入玉米自交系吉444,結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株對干旱的敏感性不同,初步認(rèn)為,轉(zhuǎn)基因植株具有抗旱性,說明蛋白激酶能夠提高玉米的耐旱性;He等[9]首次把來自細(xì)菌Aphanothecehalophytica的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和甜菜堿合成的2個關(guān)鍵酶基因ApGSMT2以及ApDMT2轉(zhuǎn)入玉米,結(jié)果表明,在干旱條件下,轉(zhuǎn)基因植株比非轉(zhuǎn)基因植株糖類和游離氨基酸的積累量增加,顯示出較強(qiáng)的抗旱性;楊政偉等[10]將源于小麥的氨基酸合成酶類的SAMS基因?qū)胗衩?結(jié)果使其抗旱性增加;Zhang等[11]則把鹽芥的轉(zhuǎn)錄因子TsCBF1基因轉(zhuǎn)入玉米,結(jié)果表明,植株的耐旱性明顯提高,單株籽粒產(chǎn)量明顯高于對照。Nguyen等[12]通過研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)HAV1基因的玉米植株,其葉片相對含水量高于非轉(zhuǎn)基因植株,且能在15 d完全干旱的條件下存活。

有研究表明,類受體激酶在植物生長、發(fā)育和對環(huán)境因素的應(yīng)激方面有重要作用。到目前為止,國內(nèi)外在進(jìn)行轉(zhuǎn)類受體激酶基因提高農(nóng)作物的耐旱性培育方面的報(bào)道還不是很多[13]。

本試驗(yàn)將水稻類受體激酶OsSIK1基因,通過山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心發(fā)明的超聲波輔助花粉介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法,對玉米自交系鄭58進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,并對其后代進(jìn)行分子檢測及抗旱性相關(guān)形態(tài)指標(biāo)、生理生化指標(biāo)的驗(yàn)證分析,最終獲得了抗旱性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因新株系,旨在為提高玉米品種抗旱性提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物轉(zhuǎn)化受體材料及供體質(zhì)粒

本試驗(yàn)植物轉(zhuǎn)化受體材料為玉米自交系鄭58,由山西省強(qiáng)盛種業(yè)有限公司提供。

供體質(zhì)粒pBin438-OsSIK1的大腸桿菌菌株DH5α,由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所陳受宜教授提供。目的基因OsSIK1從水稻中克隆,是一個RLK類基因[10],該質(zhì)粒載體中包括2個35S啟動子、1個NPTⅡ基因以及整合在限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)之間的 2 449 bp的OsSIK1基因cDNA片段。pBin438-OsSIK1質(zhì)粒圖譜如圖1所示。

圖1 植物表達(dá)載體pBin438-OsSIK1示意圖譜

1.2 轉(zhuǎn)化方法

轉(zhuǎn)化方法采用花粉介導(dǎo)法:將供試玉米自交系鄭58于5月上旬播種,待7月上、中旬開花抽絲前,將雌穗套袋隔離。盛花期當(dāng)天收集10:00左右開花的玉米花粉,懸浮于15%～20%的蔗糖溶液中,超聲波處理后,加入質(zhì)粒DNA(質(zhì)粒與花粉粒的混合比例大約為1∶20 000,m/m),再次進(jìn)行超聲波處理(超聲波處理參數(shù)為:聲強(qiáng)200 W,工作時間5 s,間隔10 s,工作次數(shù)6次)[14]。處理后的花粉略經(jīng)沉淀后倒掉上清液,涂抹于套袋隔離的玉米花絲上,并將雌穗套袋,秋季收獲T0種子。于翌年種植并進(jìn)行分子檢測。

1.3 轉(zhuǎn)化株的篩選及分子檢測

1.3.1 T0種子卡那霉素抗性篩選 將T0種子用清水浸泡24 h至種子萌動,換用350 mg/L卡那霉素溶液浸泡10 h,將處理過的種子播種于潮濕的苗床內(nèi),出芽后選擇生長健壯的非白化苗(T1植株)移栽到溫室,對該疑似轉(zhuǎn)化株進(jìn)行分子檢測。

1.3.2 T1、T2、T3植株的DNA提取及PCR檢測 T1、T2、T3株(T1植株P(guān)CR檢測陽性植株自交種子于翌年播種獲得T2植株,以此類推)生長到五-六葉期時,取其嫩葉提取總DNA(采用CTAB 法[15],參考《植物基因工程》[16]進(jìn)行)。

PCR 擴(kuò)增時以未轉(zhuǎn)化玉米植株基因組DNA為陰性對照,以無菌水為空白對照,以質(zhì)粒為陽性對照?；蛐蛄性O(shè)計(jì)特異引物,其序列如下(引物合成由上海生工生物工程公司完成)。

OsSIK1基因上游引物(5′-ATGGCGGCGGCGA GGGCGCC-3′);下游引物(5′-TCCCTGTGAGATTGT TTCCC-3′),擴(kuò)增片段大小為701 bp。擴(kuò)增采用20 μL體系:模板 DNA(50～200 ng/μL) 0.8 μL,10×PCR Buffer(含 Mg2+)2 μL,dNTP(10 mmol/L)0.4 μL,Primer Ⅰ(10 μmol/L)0.8 μL,Primer Ⅱ(10 μmol/L)0.8 μL,TaqDNA 聚合酶(5 U/μL)0.2 μL,ddH2O 15 μL。 PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 30 s,59 ℃退火1 min,72 ℃延伸 2 min,35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR 產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。

1.3.3 轉(zhuǎn)基因植株Southern Blotting檢測 將PCR檢測T3呈陽性植株的轉(zhuǎn)OsSIK1基因玉米作為提取總DNA的待測樣品,以非轉(zhuǎn)基因玉米DNA為陰性對照、質(zhì)粒DNA為陽性對照,用HindⅢ酶對檢測樣品進(jìn)行酶切,再將酶切產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠上電泳分離后,進(jìn)行Southern Blotting雜交檢測。DNA 探針使用外源OsSIK1基因部分序列700 bp設(shè)計(jì)。(Southern Blotting試驗(yàn)按照Roche公司的DIG DNA Labeling and Detection Kit試劑盒的說明書進(jìn)行。具體試驗(yàn)如DNA 變性、轉(zhuǎn)移及雜交方法,雜交后用X-光片自顯影曝光參照《分子克隆》[17]進(jìn)行)。

1.4 轉(zhuǎn)基因玉米后代的抗旱性指標(biāo)測定

取T3分子檢測陽性株系和未轉(zhuǎn)化玉米自交系鄭58玉米種子,種植到花盆中,澆Hoagland′s營養(yǎng)液培養(yǎng)至五-六葉期,選取長勢基本一致的各轉(zhuǎn)基因玉米株系和非轉(zhuǎn)基因玉米各10株,將其根部浸泡在16.1% PEG-6000 Hoagland′s溶液中,處理24 h進(jìn)行模擬水分脅迫。之后立即對處理后的各轉(zhuǎn)化株系進(jìn)行抗旱性生理生化指標(biāo)的測定,測定指標(biāo)包括:葉片相對含水量、葉綠素含量(采用丙酮浸提法測定)、SOD活性(采用氮藍(lán)四唑光化還原法測定)、細(xì)胞膜透性(采用電導(dǎo)法測定)、MDA含量(采用硫代巴比妥酸法測定),具體試驗(yàn)步驟參考文獻(xiàn)[18]的方法進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

對所取得的數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003及SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉處理后轉(zhuǎn)OsSIK1基因玉米T0種子的獲得

經(jīng)過超聲波輔助花粉介導(dǎo)法處理,將OsSIK1基因?qū)胧荏w材料玉米自交系鄭58中,共轉(zhuǎn)化572株玉米,由于處理后的花粉萌發(fā)率很低,每株獲得的種子數(shù)1～10粒不等,最終共獲得T0種子1 103 粒。

2.2 T0轉(zhuǎn)化株卡那霉素抗性初篩結(jié)果

將T0種子進(jìn)行卡那霉素溶液浸泡處理后,播種獲得T1植株,淘汰白化苗,共獲得抗性苗296株(圖2),即為卡那霉素抗性植株。

圖2 T1 植株卡那霉素篩選

2.3 T1、T2、T3轉(zhuǎn)化植株P(guān)CR分子檢測

將卡那霉素抗性初篩為陽性的幼苗移栽于大田,待幼苗長至5～6片葉時,全部取樣,提取總DNA進(jìn)行PCR分子檢測,結(jié)果顯示,初篩獲得的抗性苗296株中只有26株檢測結(jié)果為陽性,即轉(zhuǎn)化株與質(zhì)粒DNA陽性對照均擴(kuò)增出701 bp的目的片段,同時陰性對照植株P(guān)CR未擴(kuò)增出目的條帶。初步確定,這26株轉(zhuǎn)化植株含有水稻類受體激酶OsSIK1基因,轉(zhuǎn)化率為2.4%(以收獲的T0種子為基數(shù))。

將通過PCR擴(kuò)增呈陽性的T1轉(zhuǎn)化株套袋自交收獲種子,翌年按穗播種得到T2株系,每穗種植2行,每行25～28株,全部取樣進(jìn)行OsSIK1基因PCR檢測,結(jié)果顯示,T2的26個株系中有19個株系的玉米植株能夠繼續(xù)檢測出目的基因片段。同時,在這19個株系中陽性植株檢出率達(dá)45%～90%不等(圖3),表明轉(zhuǎn)入玉米植株的外源基因可以遺傳給后代,并在這一代發(fā)生了基因分離(表1)。

M.DL2000 Marker;P.質(zhì)粒;-.陰性對照;1～11.轉(zhuǎn)化植株。

將T2植株同T1植株處理,獲得了T3植株。在T3植株檢測中,由于其均是T2的PCR 陽性后代,其群體中存在目的基因純合型和雜合型2種基因型,但是表現(xiàn)為同樣的顯性性狀,若將轉(zhuǎn)化的外源基因以單拷貝形式整合到受體玉米基因組中,按孟德爾分離規(guī)律,其后代整個群體中陽性檢出分離比率應(yīng)為5∶1。在實(shí)際觀察中,其結(jié)果與預(yù)期比率其中有11個株系與理論相擬合,如株系H2、H27、H29、H102等;有7個株系比率高于預(yù)期比率,如株系H20,有1個株系未檢測出陽性植株,如H76(表1)。這可能與轉(zhuǎn)化時整合的外源基因?yàn)槎嗫截惡图訇栃杂嘘P(guān)[19]。

表1 轉(zhuǎn)OsSIK1基因玉米植株T2和T3的PCR檢測結(jié)果

2.4 T3轉(zhuǎn)基因玉米植株Southern Blotting分析

對T3的PCR 陽性植株取樣,進(jìn)行Southern Blotting分析,雜交結(jié)果顯示,上述株系轉(zhuǎn)化株出現(xiàn)特異性雜交信號(圖4),再次說明,外源基因已成功整合到部分受體玉米植株的染色體基因組上。但在T3的PCR檢測為陽性的株系中,也有部分材料在Southern Blotting雜交檢測中并未出現(xiàn)陽性條帶,說明T3轉(zhuǎn)基因植株中仍存在假陽性植株,如株系H76。

CK+.質(zhì)粒;N.陰性對照;1～4.分別為T3株系

2.5 轉(zhuǎn)OsSIK1基因玉米抗旱性分析

玉米葉片的相對含水量、葉綠素含量、SOD活性、細(xì)胞膜透性指標(biāo)和MDA含量是反映玉米抗旱性的生理生化重要指標(biāo)。試驗(yàn)中以16.1%的PEG-6000 Hoagland′s溶液對T3分子檢測呈陽性株系和非轉(zhuǎn)基因玉米植株進(jìn)行24 h水分脅迫處理,之后立即對其進(jìn)行抗旱性生理生化指標(biāo)測定,試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),所獲得的各T3轉(zhuǎn)基因株系生理生化指標(biāo)與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ站憩F(xiàn)出明顯差異。研究結(jié)合田間抗旱生理生化指標(biāo)表現(xiàn)最終獲得了5個轉(zhuǎn)OsSIK1基因玉米株系，并證明導(dǎo)入水稻OsSIK1基因可以提高玉米植株的抗旱性。

由圖5可知,在水分脅迫處理后,各轉(zhuǎn)基因玉米株系的葉片相對含水量比非轉(zhuǎn)基因玉米對照高7.4%～19.8%,且差異顯著。表明轉(zhuǎn)基因玉米植株受到水分脅迫的影響較小。

小寫字母表示同樣的處理在不同試材間

植物的光合作用在干旱脅迫下相關(guān)的酶合成受阻,導(dǎo)致其葉綠素減少,以致對植物生長發(fā)育產(chǎn)生嚴(yán)重影響。由圖6可知,轉(zhuǎn)OsSIK1基因玉米各株系的葉綠素含量平均值為1.15～2.11 mg/g,顯著高于對照平均值1.02 mg/g,其中,葉綠素含量提高了11.3%～106.9%，轉(zhuǎn)基因株系H102的葉綠素含量平均比對照高106.9%,且差異顯著。表明OsSIK1基因轉(zhuǎn)入玉米,在干旱脅迫下可以使光合系統(tǒng)受到較小的傷害。

超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶,廣泛分布于各種生物體內(nèi),其具有特殊的生理活性,是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)[20]。由圖7可知,干旱脅迫下,各轉(zhuǎn)化株系玉米的超氧化物歧化酶活性為255.38～338.75 U/g,非轉(zhuǎn)基因株系為175.12 U/g,轉(zhuǎn)化株比對照高45.8%～93.4%。說明在干旱脅迫下,OsSIK1基因的導(dǎo)入可使SOD活性大幅度提高。

圖6 模擬水分脅迫下葉綠素含量

圖7 模擬水分脅迫下SOD含量

植物細(xì)胞膜透性指標(biāo)也是反映玉米抗旱性生理生化的重要指標(biāo)。由圖8可知,當(dāng)玉米植株受到干旱脅迫時,其細(xì)胞膜選擇透性會降低,使得細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)外滲,引起組織浸泡液相對電導(dǎo)率變化。在本試驗(yàn)中,各玉米轉(zhuǎn)化株系相對電導(dǎo)率的平均值為20%～31%,而對照相對電導(dǎo)率平均值為48%，轉(zhuǎn)基因玉米葉片相對電導(dǎo)率下降了35.4%～58.1%，說明轉(zhuǎn)化株抗逆性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于對照。

圖8 模擬水分脅迫下葉片相對電導(dǎo)率

丙二醛(MDA)在植物中含量的高低,可有效地反映細(xì)胞膜脂過氧化程度和對逆境脅迫反應(yīng)的強(qiáng)弱。由圖9可知,經(jīng)干旱脅迫后,各轉(zhuǎn)基因株系的丙二醛含量平均值為22.4～33.6 μmol/g,與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏钠骄?5.2 μmol/g間有顯著性差異,各轉(zhuǎn)基因株系MDA的含量下降了25.7%～50.4%，其中,轉(zhuǎn)基因株系H102的丙二醛含量平均值僅為對照的49.6%,且差異顯著。說明OsSIK1基因在玉米中表達(dá)的水稻類受體激酶對于細(xì)胞膜透性有一定的調(diào)節(jié)作用,使膜脂抗氧化能力提高。

圖9 模擬水分脅迫下MDA含量

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)采用超聲波輔助花粉介導(dǎo)法成功地將水稻類受體激酶OsSIK1基因?qū)胗衩變?yōu)良自交系鄭58中,經(jīng)過多代的分子檢測及選擇,獲得了外源基因穩(wěn)定遺傳的高代材料,其生理生化指標(biāo)的檢測結(jié)果表明,其與原受體試材相比,抗旱性明顯提高。原受體玉米自交系鄭58作為玉米育種的核心基礎(chǔ)材料,其植株形態(tài)和農(nóng)藝性狀穩(wěn)定,具有較高的一般配合力。以鄭58為母本、昌7-2 為父本的雜交種鄭單958則以高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、多抗等突出的優(yōu)點(diǎn),被廣泛推廣種植[21]。因此,將水稻類受體激酶OsSIK1基因?qū)朐撚衩鬃越幌?提高了品種抗旱性,使其種植范圍更廣、適應(yīng)性更強(qiáng),在玉米種質(zhì)創(chuàng)新、新品種選育與應(yīng)用和產(chǎn)生更大的經(jīng)濟(jì)社會效益等方面意義重大。

類受體激酶在植物生長、發(fā)育和對環(huán)境因素的應(yīng)激方面具有重要作用。OsSIK1基因過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻植株則在干旱脅迫下表現(xiàn)出更好的耐鹽和抗旱能力,且其過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性都有大幅度提高。本試驗(yàn)首次將來源于水稻的OsSIK1基因轉(zhuǎn)入玉米,對其外源基因穩(wěn)定遺傳的高代材料進(jìn)行生理生化檢測時發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因株系葉片的相對含水量比對照非轉(zhuǎn)基因玉米高7.4%～19.8%,葉綠素含量平均比對照高11.3%～106.9%、SOD活性明顯高于對照45.8%～93.4%,且差異顯著;轉(zhuǎn)基因玉米葉片相對電導(dǎo)率下降了35.4%～58.1%,MDA含量則比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ掌骄礛DA含量下降了25.7%～50.4%,且差異顯著。試驗(yàn)結(jié)果很明確地暗示了來源于水稻的OsSIK1基因在玉米中依然可以通過激活抗氧化系統(tǒng)[12],增強(qiáng)玉米對于干旱脅迫的抗性。

外源基因能否在轉(zhuǎn)基因玉米材料中穩(wěn)定遺傳對轉(zhuǎn)基因玉米品種的選育至關(guān)重要。本試驗(yàn)在利用超聲波介導(dǎo)花粉轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化水稻OsSIK1基因獲得了轉(zhuǎn)化株系,并經(jīng)過分子檢測與田間調(diào)查統(tǒng)計(jì)時分析發(fā)現(xiàn),外源基因轉(zhuǎn)入受體玉米自交系后,其在轉(zhuǎn)基因玉米后代中的遺傳大致分3種情況:第1種是外源基因以單拷貝方式插入受體玉米植株,外源基因基本以孟德爾定律在后代群體中分離,并在3～4代后獲得基本純合的株系;第2種是轉(zhuǎn)化株在T2時分子檢測其陽性率就遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)分離比率,后經(jīng)Southern Blotting雜交檢測這種類型轉(zhuǎn)化株外源基因多以多拷貝方式整合;第3種情況是T1的PCR分子檢測呈陽性,但T2時為陰性,后經(jīng)Southern Blotting雜交檢測未發(fā)現(xiàn)外源基因條帶,應(yīng)確定為假陽性事件,在本試驗(yàn)中,該種事件發(fā)生占總轉(zhuǎn)化事件的26%。說明用花粉介導(dǎo)法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化時,雖然轉(zhuǎn)化率較高,但轉(zhuǎn)化假陽率的發(fā)生概率也較高。

此外,外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中能否正常遺傳表達(dá),對轉(zhuǎn)基因品種的選育具有重要意義。研究表明,對轉(zhuǎn)基因作物而言,目的基因在其遺傳和表達(dá)上存在不穩(wěn)定現(xiàn)象,整合到植物基因組上的外源基因由于被修飾或整合位點(diǎn)不活躍而不表達(dá)[22];目的基因可能在植物細(xì)胞減數(shù)分裂時出現(xiàn)遺傳分離或丟失。雖然沒有進(jìn)行Northern和Western雜交分析,但本試驗(yàn)在對轉(zhuǎn)基因植株抗旱性生理生化檢測時發(fā)現(xiàn),不同來源的轉(zhuǎn)化事件在生理生化指標(biāo)檢測時,存在其測量平均值與對照相比存在無差異或差異顯著以及轉(zhuǎn)化株彼此間差異顯著等多種情況。這些情況的發(fā)生可能是由轉(zhuǎn)基因植株中目的基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的差異及基因沉默等現(xiàn)象所造成。當(dāng)然,轉(zhuǎn)基因玉米的實(shí)際抗旱能力也不僅僅與抗旱生理生化指標(biāo)相關(guān),本試驗(yàn)只是對轉(zhuǎn)基因玉米苗期生理生化指標(biāo)進(jìn)行了檢測,也只是反映了該時期干旱脅迫發(fā)生時轉(zhuǎn)OsSIK1基因玉米新品系與原受體玉米自交系在生理上應(yīng)激反應(yīng)確實(shí)有了改變,且差異顯著。而轉(zhuǎn)基因玉米抽雄期、灌漿期等生育期抗旱性鑒定及外源基因蛋白表達(dá)的測定則對于生產(chǎn)更具有指導(dǎo)意義[23],其還有待于進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。

[1] 國家統(tǒng)計(jì)局.國家統(tǒng)計(jì)局關(guān)于2015年糧食產(chǎn)量的公告[EB/OL].[ 2015-12-08].http://www.yumi.com.cn/html/2015/12/20151208165617184726.html.

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Analysis on Obtaintion of Transgenic Maize Plants Transferred withOsSIK1 Gene and Their Drought Resistance

HAO Yaoshan,ZHANG Huanhuan,DU Jianzhong,WANG Yixue,SUN Yi

(Biotechnology Research Center,Shanxi Academy of Agriculture Sciences,Taiyuan 030031,China)

A Receptor-like kinase(RLK)gene,OsSIK1,plays important roles in drought stress-tolerance in rice,through the activation of the antioxidative system.To make maize plants have much more drought resistance genes and further to obtain drought tolerance maize germplasm.In this study,OsSIK1 gene of rice was transformated into maize inbred Zheng 58 plants by pollen-mediated method.First,transgenic plants in T1,T2and T3were detected by Kanamycin resistance screening,PCR and Southern Blotting,transgenic plants were obtained from T1and pure transgenic lines was obtained from T3.Next,drought resistance analysis to transgenic maize plants and non-transformation control plants were conducted under the condition of 16.1% PEG drought stress.The results showed that compared with non-transgenic plants,the seedling leaf relative water content,chlorophyll content and SOD activity of transgenic plants were increased by 7.4%-19.8%,11.3%-106.9% and 45.8%-93.4%,respectively;furthermore,the relative conductivity and MDA content were decreased by 35.4%-58.1%,and 25.7%-50.4%,respectively.All the physiological indexes under the drought stress proved that transgenicOsSIK1 gene improved the drought resistance of transgenic maize plants,further analysis found that there were significant differences on drought tolerance between 5 transformed lines and their control groups,and their performance of field were superior to that of non-transgenic maize seedlings.At last,5 transgenic maize inbred lines were obtained,which suggested that genetically modified maize has improved the drought resistance by introducing foreignOsSIK1 gene of rice.

OsSIK1 gene;Pollen mediated transformation;Transgenic maize;Drought resistance

2016-06-28

國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2016ZX08003001-002-003);山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技攻關(guān)項(xiàng)目(2013gg21)

郝曜山(1979-),男,山西清徐人,助理研究員,碩士,主要從事植物基因工程和作物遺傳育種研究。

孫 毅(1953-),男,黑龍江哈爾濱人,研究員,博士,主要從事植物基因工程和分子生物學(xué)研究。

S511

A

1000-7091(2016)05-0001-06

10.7668/hbnxb.2016.05.001