額爾和花 謝秀蘭 馬麗娜 岳彩娟 丁 偉
(寧夏農(nóng)林科學(xué)院草畜工程技術(shù)研究中心,寧夏銀川 750002)
灘羊多胎品系選育中的FecB 基因的檢測(cè)及利用
額爾和花謝秀蘭 馬麗娜 岳彩娟 丁 偉
(寧夏農(nóng)林科學(xué)院草畜工程技術(shù)研究中心,寧夏銀川 750002)
為了達(dá)到灘羊多胎品系的輔助選育的目的,試驗(yàn)利用綿羊多胎主效基因FecB 的PCR-RFLP 檢測(cè)方法檢測(cè)了寧夏靈武、鹽池兩地灘羊多胎品系基礎(chǔ)群湖羊母本及其灘湖雜一代252只個(gè)體,檢測(cè)結(jié)果為湖羊母羊公羊169只均為BB型,灘公羊4只均為++型,灘湖雜一代80只為B+基因型,其中BB型66.7%;B+型31.75%;++型1.98%,并確定了每個(gè)個(gè)體的基因型,通過基因型的判斷在選配中選留BB基因型和B+基因型,進(jìn)一步純化基因達(dá)到灘羊多胎品系選育的目的,可加速育種項(xiàng)目灘羊多胎品系的選育步伐。
灘羊品系選育FecB基因
FecB基因是在綿羊中識(shí)別出的第一個(gè)高繁殖力主效基因。家畜的產(chǎn)仔(羔)數(shù)是經(jīng)濟(jì)價(jià)值十分巨大的數(shù)量性狀,對(duì)綿羊產(chǎn)羔數(shù)的選擇不僅受到性別和年齡的限制,而且綿羊的產(chǎn)羔數(shù)是一個(gè)遺傳力很低的數(shù)量性狀,難以用常規(guī)的育種技術(shù)來改良產(chǎn)羔數(shù)性狀。王根林等和柳淑芳[1][2]等相繼分別報(bào)道了湖羊和小尾寒羊存在FecB基因,即BM PR-IB基因突變,湖羊是我國(guó)著名的多胎品種之一,育種學(xué)家們?cè)缇完P(guān)注了湖羊的多胎性,湖羊最早育成于太湖流域及周圍地區(qū),以產(chǎn)羔率高和盛產(chǎn)優(yōu)質(zhì)羔皮而著稱,而灘羊是我國(guó)特有的輕裘皮用單羔綿羊品種,所產(chǎn)的二毛裘皮以質(zhì)地輕軟、花穗圖案清晰美麗、灘羊肉以肌肉纖維密、脂肪分布均勻、含量適中、組織含水量較高、嫩香、無膻味而聞名海內(nèi)外,但是繁殖力低下是限制灘羊生產(chǎn)性能的主要因素之一,為了合理利用灘羊的種質(zhì)特性,同時(shí)發(fā)揮湖羊多胎高產(chǎn)的優(yōu)勢(shì),以灘羊?yàn)楦副竞驗(yàn)槟副荆瑢鹘y(tǒng)的常規(guī)表型選擇育種和FecB基因分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)相結(jié)合,開展了新品種(系)培育工作,本研究應(yīng)用PCR-RFLP方法對(duì)湖羊母本及灘湖雜交后代進(jìn)行了多胎主效基因FecB檢測(cè),以期加速灘羊多胎品系的選育步伐。
1.1樣品采集和DNA提取
湖羊母本及灘湖雜交后代樣品分別采自寧夏靈武、鹽池兩地灘羊多胎品系基礎(chǔ)群共252只,每只綿羊頸靜脈采血2~5 ml,檸檬酸葡萄糖抗凝,顛倒混勻以防止血液凝固,低溫(4℃以下)帶回實(shí)驗(yàn)室,分裝后-80℃長(zhǎng)期凍存。冷凍血液在室溫融化后,取700μl移至1.5ml 離心管中,應(yīng)用血液DNA提取試劑盒(天根生物技術(shù)有限公司)提取血液基因組DNA,0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總DNA,并用核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定其濃度和純度,在- 20℃以下的低溫保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2引物序列
引物序列參照儲(chǔ)明星[3][4]等文獻(xiàn)報(bào)道的綿羊多胎主效基因FecB分子檢測(cè)方法,預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小為140 bp。
上游引物:5'-GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG-3';
下游引物:5'-CAAGATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGTC-3'。
1.3PCR 擴(kuò)增
PCR 擴(kuò)增體系:PCR 擴(kuò)增反應(yīng)總體積為25 μl,其中2×Taq PCR master Mix 12.5 μl,10 μmol/L 上下游引物各1.0 μl,去離子水10.5 μl。PCR 擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,60℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,33 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5min,4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
1.4PCR產(chǎn)物的酶切檢測(cè)
RFLP 酶切體系:PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用AvaⅡ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切,酶切反應(yīng)總體積為15μl,其中PCR 產(chǎn)物5 μl,10×緩沖液1.5 μl,10U/μl Ava Ⅱ限制性內(nèi)切酶1.0 μl,去離子水7.5μl。振蕩、短暫離心(轉(zhuǎn)速達(dá)12 000 r/min 即可),酶切反應(yīng)條件為37℃水浴4 h。RFLP 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè):酶切產(chǎn)物用3.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
2.1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及酶切檢測(cè)
用引物對(duì)綿羊基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物僅出現(xiàn)140bp 條帶(圖1,A),擴(kuò)增特異性較好,并進(jìn)行了進(jìn)一步的酶切檢測(cè)。
圖1 FecB 基因PCR電泳圖
圖2 FceB基因的PCR-RFLP電泳檢測(cè)圖
2.2RFLP檢測(cè)
用Ava Ⅱ限制性內(nèi)切酶對(duì)不同個(gè)體PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切,結(jié)果檢測(cè)出3 種基因型(++、B+ 和BB),如圖2所示(110 /110 bp)條帶表示為2 個(gè)FecB 拷貝的攜帶者,即BB 型,純合子個(gè)體;(140 /110 bp)兩條帶表示為1 個(gè)FecB 拷貝的攜帶者,即B+ 型,雜合子;FecB 拷貝的非攜帶者(140 /140 bp),即++ 型。
2.3檢測(cè)結(jié)果
利用綿羊多胎主效基因FecB 的PCR-RFLP 檢測(cè)方法檢測(cè)了寧夏靈武、鹽池兩地灘羊多胎品系基礎(chǔ)群湖羊及其灘湖雜一代252只,等位基因和基因型概率如表1所示,其中BB型66.7% (168/252);B+型31.75%(80/252);++型1.98%(5/252)。
表1 酶切檢測(cè)結(jié)果
為了灘羊多胎品系的選育,課題組對(duì)選育雜交母本湖羊以及灘湖雜一代進(jìn)行了FecB檢測(cè)。FecB是在布魯拉美利奴(Booroola Merino)綿羊中發(fā)現(xiàn)的能增加排卵數(shù)和產(chǎn)羔數(shù)的一個(gè)常染色體突變基因(Davis et al.,1982;Piper and Bindon,1982),攜帶FecB 基因的綿羊其高繁殖力是BMPR-IB基因突變的結(jié)果,F(xiàn)ecB 即BMPR-IB 基因的746G 或249R,F(xiàn)ec+即BMPR-IB 基因的746A 或249Q[3-5],這為綿羊多胎基因FecB 的檢測(cè)提供了直接的分子標(biāo)記。
利用PCR-RFLP 方法對(duì)灘羊多胎品系基礎(chǔ)群進(jìn)行FecB基因檢測(cè),結(jié)果為湖羊母羊公羊169只均為BB型,灘公羊4只均為++型,灘湖雜一代80只為B+基因型,通過基因型的判斷在灘羊多胎品系選育中多選留攜帶高繁殖力基因FecB的BB基因型和B+基因型的母羊和公羊選配,有利于綿羊多胎基因頻率的提高和基因型的純化,實(shí)現(xiàn)早期快速、準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)綿羊產(chǎn)羔情況,達(dá)到輔助育種的目的。據(jù)報(bào)道[6]在綿羊群體中導(dǎo)入多胎基因,能夠顯著提高單位母羊存欄羔羊總重,在實(shí)際綿羊生產(chǎn)中,多產(chǎn)羔與單位母羊總產(chǎn)肉貢獻(xiàn)率成正比,多胎性能是綿羊高產(chǎn)的基礎(chǔ),也是提高綿羊養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益的最重要的因素之一,因此,世界主要養(yǎng)羊國(guó)對(duì)綿羊多胎基因的研究特別重視,通過標(biāo)記輔助導(dǎo)入湖羊的多胎基因培育灘羊新品系是提高灘羊產(chǎn)肉率和生產(chǎn)性能的有效途徑。因此,在選育中要繼續(xù)加強(qiáng)多胎基因檢測(cè),以確保多胎基因的純化,促進(jìn)育種進(jìn)程。
[1]王根林.DNA 分析發(fā)現(xiàn)我國(guó)湖羊和小尾寒羊存在 Booroola (FecB)多胎基因[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,26(1):104-106.
[2]柳淑芳.BMPR - IB 和 BMP15 基因作為小尾寒羊多胎性能候選基因的研究[J].遺傳學(xué)報(bào),2003,30(8):755- 760.
[3]儲(chǔ)明星,狄冉.綿羊多胎主效基因FecB 分子檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2009,17(1):52-58.
[4]額爾和花,黃順國(guó),丁偉,等.灘羊及其雜改群體中 BMPR—IB基因的研究[J].寧夏農(nóng)林科技,2009,(3):6-7.
[5]黃順國(guó),額爾和花,王新燕,等.綿羊多胎基因BMPR-IB,BMP15的研究進(jìn)展[J].農(nóng)業(yè)科學(xué)研究,28(3):68-71.
寧夏回族自治區(qū)育種專項(xiàng)項(xiàng)目,編號(hào)2013NYYZ0404,寧夏農(nóng)林科學(xué)院先導(dǎo)項(xiàng)目,編號(hào),NKYJ-14-09
額爾和花(1973-),女,內(nèi)蒙古赤峰市人,碩士學(xué)歷,副研究員,主要從事畜禽養(yǎng)殖業(yè)及遺傳育種方面的研究。
丁偉(1971-),男,寧夏銀川市人,本科學(xué)歷,副研究員,研究方向:畜禽養(yǎng)殖業(yè)及遺傳育種。