額爾和花　謝秀蘭 馬麗娜 岳彩娟 丁 偉

（寧夏農(nóng)林科學院草畜工程技術研究中心，寧夏銀川 750002）

灘羊多胎品系選育中的FecB 基因的檢測及利用

額爾和花謝秀蘭 馬麗娜 岳彩娟 丁 偉

（寧夏農(nóng)林科學院草畜工程技術研究中心，寧夏銀川 750002）

為了達到灘羊多胎品系的輔助選育的目的，試驗利用綿羊多胎主效基因FecB 的PCR-RFLP 檢測方法檢測了寧夏靈武、鹽池兩地灘羊多胎品系基礎群湖羊母本及其灘湖雜一代252只個體，檢測結果為湖羊母羊公羊169只均為BB型，灘公羊4只均為++型，灘湖雜一代80只為B+基因型，其中BB型66.7%；B+型31.75%；++型1.98%，并確定了每個個體的基因型，通過基因型的判斷在選配中選留BB基因型和B+基因型，進一步純化基因達到灘羊多胎品系選育的目的，可加速育種項目灘羊多胎品系的選育步伐。

灘羊品系選育FecB基因

FecB基因是在綿羊中識別出的第一個高繁殖力主效基因。家畜的產(chǎn)仔（羔）數(shù)是經(jīng)濟價值十分巨大的數(shù)量性狀，對綿羊產(chǎn)羔數(shù)的選擇不僅受到性別和年齡的限制，而且綿羊的產(chǎn)羔數(shù)是一個遺傳力很低的數(shù)量性狀，難以用常規(guī)的育種技術來改良產(chǎn)羔數(shù)性狀。王根林等和柳淑芳[1］[2］等相繼分別報道了湖羊和小尾寒羊存在FecB基因，即BM PR-IB基因突變，湖羊是我國著名的多胎品種之一，育種學家們早就關注了湖羊的多胎性，湖羊最早育成于太湖流域及周圍地區(qū)，以產(chǎn)羔率高和盛產(chǎn)優(yōu)質羔皮而著稱，而灘羊是我國特有的輕裘皮用單羔綿羊品種，所產(chǎn)的二毛裘皮以質地輕軟、花穗圖案清晰美麗、灘羊肉以肌肉纖維密、脂肪分布均勻、含量適中、組織含水量較高、嫩香、無膻味而聞名海內外，但是繁殖力低下是限制灘羊生產(chǎn)性能的主要因素之一，為了合理利用灘羊的種質特性，同時發(fā)揮湖羊多胎高產(chǎn)的優(yōu)勢，以灘羊為父本湖羊為母本，將傳統(tǒng)的常規(guī)表型選擇育種和FecB基因分子標記輔助選擇育種技術相結合，開展了新品種（系）培育工作，本研究應用PCR-RFLP方法對湖羊母本及灘湖雜交后代進行了多胎主效基因FecB檢測，以期加速灘羊多胎品系的選育步伐。

1　材料與方法

1.1樣品采集和DNA提取

湖羊母本及灘湖雜交后代樣品分別采自寧夏靈武、鹽池兩地灘羊多胎品系基礎群共252只，每只綿羊頸靜脈采血2～5 ml，檸檬酸葡萄糖抗凝，顛倒混勻以防止血液凝固，低溫（4℃以下）帶回實驗室，分裝后-80℃長期凍存。冷凍血液在室溫融化后，取700μl移至1.5ml 離心管中，應用血液DNA提取試劑盒（天根生物技術有限公司）提取血液基因組DNA，0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA，并用核酸濃度測定儀測定其濃度和純度，在- 20℃以下的低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2引物序列

引物序列參照儲明星[3][4］等文獻報道的綿羊多胎主效基因FecB分子檢測方法，預期擴增產(chǎn)物大小為140 bp。

上游引物：5'-GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG-3'；

下游引物：5'-CAAGATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGTC-3'。

1.3PCR 擴增

PCR 擴增體系：PCR 擴增反應總體積為25 μl，其中2×Taq PCR master Mix 12.5 μl，10 μmol/L 上下游引物各1.0 μl，去離子水10.5 μl。PCR 擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，33 個循環(huán)；72 ℃延伸5min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4PCR產(chǎn)物的酶切檢測

RFLP 酶切體系：PCR 擴增產(chǎn)物用AvaⅡ限制性內切酶進行酶切，酶切反應總體積為15μl，其中PCR 產(chǎn)物5 μl，10×緩沖液1.5 μl，10U/μl Ava Ⅱ限制性內切酶1.0 μl，去離子水7.5μl。振蕩、短暫離心（轉速達12 000 r/min 即可），酶切反應條件為37℃水浴4 h。RFLP 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測：酶切產(chǎn)物用3.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2　結果與分析

2.1PCR擴增產(chǎn)物及酶切檢測

用引物對綿羊基因組DNA進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物僅出現(xiàn)140bp 條帶（圖1，A），擴增特異性較好，并進行了進一步的酶切檢測。

圖1　FecB 基因PCR電泳圖

圖2　FceB基因的PCR-RFLP電泳檢測圖

2.2RFLP檢測

用Ava Ⅱ限制性內切酶對不同個體PCR 擴增產(chǎn)物進行酶切，結果檢測出3 種基因型（++、B+ 和BB），如圖2所示（110 /110 bp）條帶表示為2 個FecB 拷貝的攜帶者，即BB 型，純合子個體；（140 /110 bp）兩條帶表示為1 個FecB 拷貝的攜帶者，即B+ 型，雜合子；FecB 拷貝的非攜帶者（140 /140 bp），即++ 型。

2.3檢測結果

利用綿羊多胎主效基因FecB 的PCR-RFLP 檢測方法檢測了寧夏靈武、鹽池兩地灘羊多胎品系基礎群湖羊及其灘湖雜一代252只，等位基因和基因型概率如表1所示，其中BB型66.7% （168/252）；B+型31.75%（80/252）；++型1.98%（5/252）。

表1　酶切檢測結果

3　結論與討論

為了灘羊多胎品系的選育，課題組對選育雜交母本湖羊以及灘湖雜一代進行了FecB檢測。FecB是在布魯拉美利奴（Booroola Merino）綿羊中發(fā)現(xiàn)的能增加排卵數(shù)和產(chǎn)羔數(shù)的一個常染色體突變基因（Davis et al.，1982；Piper and Bindon，1982），攜帶FecB 基因的綿羊其高繁殖力是BMPR-IB基因突變的結果，F(xiàn)ecB 即BMPR-IB 基因的746G 或249R，F(xiàn)ec+即BMPR-IB 基因的746A 或249Q[3-5］，這為綿羊多胎基因FecB 的檢測提供了直接的分子標記。

利用PCR-RFLP 方法對灘羊多胎品系基礎群進行FecB基因檢測，結果為湖羊母羊公羊169只均為BB型，灘公羊4只均為++型，灘湖雜一代80只為B+基因型，通過基因型的判斷在灘羊多胎品系選育中多選留攜帶高繁殖力基因FecB的BB基因型和B+基因型的母羊和公羊選配，有利于綿羊多胎基因頻率的提高和基因型的純化，實現(xiàn)早期快速、準確的預測綿羊產(chǎn)羔情況，達到輔助育種的目的。據(jù)報道[6］在綿羊群體中導入多胎基因，能夠顯著提高單位母羊存欄羔羊總重，在實際綿羊生產(chǎn)中，多產(chǎn)羔與單位母羊總產(chǎn)肉貢獻率成正比，多胎性能是綿羊高產(chǎn)的基礎，也是提高綿羊養(yǎng)殖經(jīng)濟效益的最重要的因素之一，因此，世界主要養(yǎng)羊國對綿羊多胎基因的研究特別重視，通過標記輔助導入湖羊的多胎基因培育灘羊新品系是提高灘羊產(chǎn)肉率和生產(chǎn)性能的有效途徑。因此，在選育中要繼續(xù)加強多胎基因檢測，以確保多胎基因的純化，促進育種進程。

[1]王根林.DNA 分析發(fā)現(xiàn)我國湖羊和小尾寒羊存在 Booroola （FecB）多胎基因[J］.南京農(nóng)業(yè)大學學報，2003，26（1）：104-106.

[2]柳淑芳.BMPR - IB 和 BMP15 基因作為小尾寒羊多胎性能候選基因的研究[J］.遺傳學報，2003，30（8）：755- 760.

[3]儲明星，狄冉.綿羊多胎主效基因FecB 分子檢測方法的建立與應用[J］.農(nóng)業(yè)生物技術學報，2009，17（1）：52-58.

[4]額爾和花，黃順國，丁偉，等.灘羊及其雜改群體中 BMPR—IB基因的研究[J］.寧夏農(nóng)林科技，2009，（3）：6-7.

[5]黃順國，額爾和花，王新燕，等.綿羊多胎基因BMPR-IB，BMP15的研究進展[J］.農(nóng)業(yè)科學研究，28（3）：68-71.

寧夏回族自治區(qū)育種專項項目，編號2013NYYZ0404，寧夏農(nóng)林科學院先導項目，編號，NKYJ-14-09

額爾和花（1973-），女，內蒙古赤峰市人，碩士學歷，副研究員，主要從事畜禽養(yǎng)殖業(yè)及遺傳育種方面的研究。

丁偉（1971-），男，寧夏銀川市人，本科學歷，副研究員，研究方向：畜禽養(yǎng)殖業(yè)及遺傳育種。