唐玉蓉，孫婷婷，王際亮，伊心浩

(山東省勝利油田中心醫(yī)院1.檢驗(yàn)科；2.科教科,山東 東營257034)

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*通訊作者

兒童特發(fā)性血小板減少性紫癜Th亞群細(xì)胞因子測定與骨髓巨核細(xì)胞分類的意義

唐玉蓉1，孫婷婷1，王際亮1，伊心浩2*

(山東省勝利油田中心醫(yī)院1.檢驗(yàn)科；2.科教科,山東 東營257034)

據(jù)報(bào)道兒童免疫性血小板減少性紫癜(ITP)的發(fā)病率為1.9-6.4/10萬[1]，由于病因、發(fā)病機(jī)理仍不十分明確，推測與多種誘因有關(guān)，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)細(xì)胞免疫和體液免疫紊亂。本研究通過判斷患兒的Th1/ Th2細(xì)胞因子極化狀態(tài)及Th3細(xì)胞因子與骨髓原幼巨核細(xì)胞是否有相關(guān)性，旨在探討Th各類型細(xì)胞因子與ITP發(fā)病的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

2014年1月至2016年1月在勝利油田中心醫(yī)院兒科住院且初次確診為ITP患兒。依據(jù)張之楠[2]主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》作為診斷標(biāo)準(zhǔn)。急性特發(fā)性血小板減少性紫癜(aITP)患兒24例，男性10例，女性14例，年齡在2.7歲到13.4歲之間；慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜(cITP)患兒20例，男性11例，女性9例，年齡在2.1歲到12.3歲之間。對(duì)照組為同期骨髓檢查基本正常的住院兒童25例，男10例，女15例，年齡在2.5歲到12.8歲之間。各實(shí)驗(yàn)對(duì)象需排除感染，且近期無手術(shù)及創(chuàng)傷。年齡和性別各組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

1.2 儀器和試劑

流式細(xì)胞儀為Epics XL型(美國Beckman coulter公司)，Elx80型酶聯(lián)免疫儀(美國BioTeic公司)，F(xiàn)ITC-Cy5-抗人CD3單克隆抗體、PE-抗人CD8單克隆抗體及IgG同型對(duì)照、FITC-抗人IFN-γ單克隆抗體、PE-抗人IL-4單克隆抗體均購自美國BD公司，淋巴細(xì)胞分層液、伏波酯乙醇(PMA)、離子霉素(ionomycin)和蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑莫能霉素(monensin)均為Sigma公司的產(chǎn)品，紅細(xì)胞裂解液(美國ImmunoProbe公司)，Reagent A和Reagent B均為An Der Crub公司的產(chǎn)品。TGF-β1 ELISA檢測試劑盒為科華生物公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) ①無菌采集ITP患兒肝素抗凝的靜脈血4 ml，先取100 μl新鮮抗凝血，用RPMI1640[不含小牛血清-磷酸鹽緩沖液(PBS)]1∶1等體積稀釋。加1 μg/mL PMA12 μl、1 μg/mL離子霉素4 μl及1 mg/mL的莫能霉素3.4 μl混勻；37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-6 h。②另取3 ml新鮮抗凝血，用密度梯度離心法分離PBMC，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整PBMC密度為1×109/L；取2 ml細(xì)胞懸液加入PMA(終濃度為50 μg/L)和離子霉素(終濃度為1 μmol /L)，置37℃溫箱中培養(yǎng)過夜，收集上清置-70℃凍存待測細(xì)胞因子。

1.3.2 細(xì)胞染色 將培養(yǎng)后的外周血細(xì)胞平均分為A、B兩管，各加入20 μl CD3、CD8單抗混勻，37℃避光孵育15 min；加固定劑A 200 μl 37℃避光孵育15 min，加PBS 3 ml震蕩，1200 r/min離心5 min。棄上清后，A管和B管同時(shí)加破膜劑B 100 μL，A管加抗IFN-γ、IL-4單抗，B管加入同型對(duì)照IgG單抗，37℃避光孵育15 min，PBS洗滌、離心、棄上清液。最后以PBS懸浮細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測樣本CD3+，CD8-細(xì)胞中表達(dá)IFN-γ，IL-4的陽性百分比。

所得數(shù)據(jù)采用Partec軟件進(jìn)行分析，以CD3+，CD8-設(shè)門表達(dá)CD4+T細(xì)胞(Th)，分析標(biāo)本中Th1和Th2細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例。

1.3.3 TGF-β1檢測 取上述凍存的PBMC培養(yǎng)上清，ELISA檢測其TGF-β1的水平，操作按試劑盒說明進(jìn)行，酶聯(lián)儀上測定450 nm波長吸光度(A450)。

1.3.4 骨髓片姬姆薩-瑞氏染色，自然干燥后在低倍鏡下查找骨髓巨核細(xì)胞，并在油鏡下進(jìn)行分類。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 外周血Th細(xì)胞分泌的因子在ITP患兒與正常對(duì)照兒童中水平變化

外周血Th1細(xì)胞表達(dá)的IFN-γ在aITP患兒中的百分比較正常對(duì)照組顯著增高 (P<0.05)；在cITP患兒中較對(duì)照組顯著降低 (P<0.01)；aITP、cITP和對(duì)照組三組之間的差異有顯著性(P<0.05)。Th2細(xì)胞表達(dá)的IL-4因子在aITP患兒中的表達(dá)較對(duì)照組低(P>0.05)，兩組間無顯著性差異；在cITP患兒中的表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)，有顯著性差異。在aITP患兒中Th1/Th2較對(duì)照組升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在cITP患兒中Th1/Th2較對(duì)照組降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在aITP患兒中的外周血單個(gè)核細(xì)胞Th3細(xì)胞表達(dá)的因子TGF-β1水平較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，而cITP患兒的TGF-β1水平較aITP組顯著降低(P<0.05)；aITP、cITP和對(duì)照組三組間有顯著性差異，結(jié)果見表1。

表1 ITP患兒與正常對(duì)照兒童外周血中細(xì)胞因子水平比較±s)

與對(duì)照組比較，△△P<0.01，△P<0.05；與aITP組比較，#P<0.05

2.2 ITP患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞TGF-β1與骨髓原幼巨核細(xì)胞百分比分析

實(shí)驗(yàn)表明，外周血單個(gè)核細(xì)胞TGF-β1因子水平在aITP患兒中的表達(dá)與骨髓原、幼巨核細(xì)胞百分比呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，外周血單個(gè)核細(xì)胞TGF-β1因子水平在cITP患兒中與骨髓原、幼巨核細(xì)胞正相關(guān)，結(jié)果見表2和圖1。

表2 外周血單個(gè)核細(xì)胞TGF-β1與骨髓原、幼巨核細(xì)胞之間相關(guān)性分析

圖1 外周血單個(gè)核細(xì)胞TGF-β1與骨髓原、幼巨核細(xì)胞之間相關(guān)性分析

3 討論

免疫性血小板減少癥在兒童出血性疾病中最為常見，各年齡段均可以發(fā)病，國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道兒童ITP 3歲以下嬰幼兒多見[3]，且隨著年齡的增長，兒童cITP的發(fā)病率呈增長趨勢。近年來越來越多的研究支持免疫功能紊亂是ITP發(fā)病的主要原因。淋巴細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子表達(dá)及功能的變化引發(fā)了異常的體液免疫和細(xì)胞免疫，是ITP發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)。其中免疫功能異常的T細(xì)胞，特別是CD4+T淋巴細(xì)胞在ITP的發(fā)病過程中免疫功能及其分泌的細(xì)胞因子起了非常重要作用。CD4+T淋巴細(xì)胞中Th1 亞型細(xì)胞因子的功能是通過介導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫來參與巨噬細(xì)胞的活化過程，代表因子有IL-2、IFN-γ； Th2亞型細(xì)胞因子的功能是通過介導(dǎo)機(jī)體體液免疫誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體，代表因子有IL-4， IL-5， IL-10，但是IL-10可以由如單核細(xì)胞等非 T 細(xì)胞產(chǎn)生而影響其水平，而IL-4， IL-5主要由Th2 型細(xì)胞活化后分泌的。Th3亞型細(xì)胞的功能通過分泌免疫調(diào)節(jié)因子參與機(jī)體免疫耐受誘導(dǎo)，以能下調(diào)抗原提呈細(xì)胞的TGF-β1為代表。

本研究發(fā)現(xiàn)，外周血CD4+的IFN-γ因子 在aITP兒童組中高表達(dá)，提示aITP急性期時(shí)增強(qiáng)了外周血T細(xì)胞是從Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，疾病優(yōu)勢表達(dá)Th1；而cITP組中外周血CD4+細(xì)胞的IFN-γ因子低表達(dá)及IL-4因子的高表達(dá)，提示發(fā)病時(shí)，機(jī)體明顯減弱了外周血T細(xì)胞由Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞的分化，疾病相對(duì)優(yōu)勢表達(dá)Th2。TGF-β1的表達(dá)在兒童ITP患者中均低表達(dá)，提示機(jī)體對(duì)B細(xì)胞的抑制可能隨著TGF-β1因子的表達(dá)減低而減弱， B細(xì)胞增殖可能更活躍，更加容易激活抗血小板抗體對(duì)外周血血小板的作用，進(jìn)一步加劇血小板的破壞；B細(xì)胞抑制減弱還會(huì)促進(jìn)其誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的激活、加劇補(bǔ)體的形成和增強(qiáng)細(xì)胞毒的活性，最終大量破壞巨核細(xì)胞和外周血中的血小板而引發(fā)疾病。三種細(xì)胞因子在外周血中的不同變化，證實(shí)了cITP患兒和aITP患兒均存在不同程度機(jī)體細(xì)胞免疫和機(jī)體體液免疫異常，而體液免疫在cITP患兒中表現(xiàn)更明顯，提示機(jī)體的免疫紊亂則更為嚴(yán)重。

同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)aITP和cITP患兒均存Th1/Th2功能極化異常。Dominguez等[4]在研究中發(fā)現(xiàn)Th1/Th2細(xì)胞間的平衡是影響免疫功能的重要環(huán)節(jié)。aITP和cITP的患兒細(xì)胞因子在本實(shí)驗(yàn)中呈相反的極化改變，說明在免疫機(jī)制上，兩種疾病可能存在本質(zhì)區(qū)別。細(xì)胞因子呈Th1優(yōu)勢表達(dá)的是aITP組患兒，提示機(jī)體的免疫功能亢進(jìn)是由自身反應(yīng)性細(xì)胞免疫引起的，而在相對(duì)優(yōu)勢表達(dá)Th2細(xì)胞因子的cITP患兒組則提示機(jī)體增強(qiáng)的是體液免疫，這與本實(shí)驗(yàn)中Th3細(xì)胞因子表達(dá)TGF-β1結(jié)果相一致，均提示cITP體液免疫更明顯。

同時(shí)，TGF-β1主要是由骨髓幼稚巨核細(xì)胞分泌，外周血單個(gè)核細(xì)胞TGF-β1含量降低，可能反映骨髓幼稚巨核細(xì)胞生成TGF-β1障礙。aITP患兒的原幼稚巨核細(xì)胞比例明顯增多，且TGF-β1含量與之呈負(fù)相關(guān)，驗(yàn)證了該推測。cITP患兒骨髓中原、幼稚巨核比例正常，其結(jié)果與外周血單個(gè)核細(xì)胞TGF-β1含量正相關(guān)，提示TGF-β1在aITP和cITP中的發(fā)病機(jī)制不同，可能參與了aITP的發(fā)病機(jī)制。

aITP患兒中TGF-β1濃度低于正常組對(duì)照，有觀點(diǎn)認(rèn)為Tr細(xì)胞活化后，可通過分泌TGF-β1等抑制性細(xì)胞分子調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能，由于aITP中的Tr細(xì)胞活化受抑制導(dǎo)致TGF-β1含量下降，使T細(xì)胞功能混亂，導(dǎo)致抗血小板抗體增多，血小板破壞增多[5]。而TGF-β1主要是由幼稚巨核細(xì)胞生成，外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌的TGF-β1降低考慮可能與骨髓巨核細(xì)胞分泌TGF-β1障礙相關(guān)，提示其可能作為aITP患兒療效檢測的因子，相互之間的作用機(jī)制有待遇進(jìn)一步探討研究。

在cITP中，外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌的TGF-β1的變化與骨髓原幼巨核細(xì)胞比例正相關(guān)，提示可能與全身免疫異常有關(guān)系，除了骨髓外，其他細(xì)胞影響TGF-β1分泌所致[6]。本研究cITP的病例較少，TGF-β1 在cITP中發(fā)揮的作用可能更復(fù)雜，有待于進(jìn)一步擴(kuò)大樣本研究。

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1007-4287(2016)10-1746-03

2016-04-07)