鄭 廣，楊玉雙，劉冬娜，施凱耀，孟繁波

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 心血管內(nèi)科，吉林 長春130033)

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外周血TTC7B基因高表達可能作為急性心肌梗死風險評估的分子標記

鄭 廣，楊玉雙，劉冬娜，施凱耀，孟繁波*

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 心血管內(nèi)科，吉林 長春130033)

冠心病(CAD)和急性心肌梗死(AMI)發(fā)病率呈逐年增高趨勢，其中遺傳因素在這組疾病的發(fā)病和進展中起了重要作用[1]。全基因組關聯(lián)分析(GWAS)確立了多個與冠心病和急性心肌梗死疾病的相關位點，這些基因位點的功能包括炎性反應[2]、粥樣斑塊進展[3]、平滑肌細胞增殖[4]等。多項研究表明染色體9p21與冠心病和心肌梗死發(fā)病有關[5-7]，有報道稱9p21可促進動脈粥樣硬化[3]。多個基因位點(PSRC1 at 1P13.3,MIA3 at 1q41,and SMAD3 at 15q22.33)在促進或抑制細胞生長方面扮演了重要角色，這些生物學過程在動脈粥樣硬化斑塊進展和斑塊穩(wěn)定性方面起著重要作用[11]。

然而，作為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，從穩(wěn)定型心絞痛(SA)向急性心肌梗死演變的過程中是否有遺傳因素參與，仍不清楚。本研究通過檢測TTC7B基因在AMI病人中表達量，從而明確TTC7B基因在SA向AMI轉(zhuǎn)變中是否發(fā)揮作用。

1 資料及方法

1.1 臨床資料

選取在2014年11月-2015年3月期間在吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院住院的中國北方漢族人患者30人，其中穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死分別為15人，并收集統(tǒng)計患者基線信息。所有患者均行冠狀動脈造影檢查明確診斷。本研究中，穩(wěn)定型心絞痛診斷標準[9]和急性心肌梗死診斷標準[10]均按照最新國際指南執(zhí)行。

穩(wěn)定型心絞痛組15人(男∶女為9∶6)，平均年齡為58.67±6.82歲，所有患者平板運動實驗陽性，冠脈造影檢查顯示一個及以上的冠脈分支、段狹窄≥50%；急性心肌梗死組患者15人(男∶女為11∶4)，平均年齡為58.20±9.667歲，所有患者從出現(xiàn)癥狀到入院時間均<12 h。

排除標準：兩組入選者均排除靜脈血栓、嚴重肝腎功能不全、急慢性炎癥性疾病、腫瘤、血液病等。

實驗方案經(jīng)吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院倫理委員會審核通過，所有患者均簽署知情同意。

1.2 方法

1.2.1 總RNA和總蛋白提取 使用TIANGEN TRNzol-A+ Reagent總RNA提取試劑盒進行RNA提取，使用蛋白質(zhì)提取試劑盒(中國武漢博士德生物科技公司)提取新鮮血液中總蛋白，實驗步驟參照說明書。使用分光光度計(Thermo NANODROP-2000)測定RNA濃度和純度，蛋白質(zhì)濃度采用BCA法測定 。

1.2.2 引物設計與合成 利用NCBI生物信息學數(shù)據(jù)庫查詢TTC7B基因序列，設計TTC7B基因定量引物如表1所示，由上海生物工程股份有限公司合成。

表1 引物序列

1.2.3 cDNA的合成 使用TOYOBO Rever Tra Ace試劑盒。首先對RNA進行65℃變性反應，然后按以下體系加樣：RNA 7 μl(1 μg)，primer mix 0.5 μl,RT Enzyme Mix 0.5 μl,5×RT Buffer 2 μl,Total volume 10 μl?；靹蚝蠓湃階pplied Biosystems 9700 Thermocycler PCR儀中，37℃反應15 min，然后98℃變性5 min，迅速置于冰上，得到cDNA產(chǎn)物，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 熒光定量檢測穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死患者外周血中TTC7B基因表達量 本實驗采用SYBR-GreenⅠ染料法對TTC7B基因行實時熒光定量PCR檢測。每個樣品設3個重復，以GAPDH作為內(nèi)參。在進行PCR反應之前，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行1∶10稀釋，然后進行qPCR反應。Real-time PCR反應體系如下：cDNA 2 μl，PCR-Master Mix 10 μl，PCR-F-Primer 0.5 μl，PCR-R-Primer 0.5 μl，RNase free H2O 7 μl，Total volume 20 μl。充分混勻，并放入八連管中離心20 s后，放入Mx3005P熒光定量儀中進行擴增反應。反應條件為95℃預變性1 min；95℃變性5 s，60℃退火30 s，40個循環(huán)，反應結(jié)束之后，記錄 60℃-95℃溫度范圍內(nèi)的熔解曲線及擴增曲線，產(chǎn)物4℃保存?zhèn)溆谩?shù)據(jù)由Mx3005P熒光定量PCR儀隨機附帶軟件計算得出。用 2-△△CT法進行相對定量的計算，所得數(shù)據(jù)用 SPSS23.0 軟件統(tǒng)計分析。

1.2.5 蛋白免疫印跡技術檢測心?；颊吆凸谛牟』颊咧蠺TC7B基因表達量 隨機從所選患者中抽取6名患者，分別為3名心?；颊吆?名冠心病患者進行蛋白質(zhì)提取，將提取的蛋白質(zhì)通過BCA法進行總蛋白濃度的測定，并且使用內(nèi)參基因β-Actin進行蛋白均一性標定，最終通過western blot及灰度值分析來確定心梗患者和冠心病患者中TTC7B基因表達量的高低。

1.2.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 23.0進行統(tǒng)計分析，計量資料采用t檢驗，用均數(shù)±標準差進行統(tǒng)計描述；計數(shù)資料采用卡方檢驗或fisher檢驗，用頻數(shù)和率進行統(tǒng)計描述；如P<0.05，則認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 病人的基線資料 如表2所示，兩組患者在性別、年齡、體重指數(shù)(BMI)、吸煙史、飲酒史、膽固醇水平、甘油三酯水平、低密度脂蛋白水平、高密度脂蛋白水平、是否合并高血壓、是否合并糖尿病均無顯著差異(P>0.05)。

表2 病人基線資料統(tǒng)計分析

注：*為fisher檢驗

2.2 RNA提取結(jié)果 經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(如圖1)，RNA提取效果較好，沒有降解。

2.3 TTC7B基因mRNA的表達量檢測 qPCR溶解曲線和擴增曲線表明(如圖2)，TTC7B基因和內(nèi)參基因GAPDH擴增條帶單一，無引物二聚體和非特異性條帶，擴增效率較好。從冠心病患者和心?；颊邫z測結(jié)果可以看出，TTC7B基因在心?；颊叩谋磉_量為冠心病患者的3.24倍(如圖3)(P<0.01)。

注：泳道1-4為RNA的提取結(jié)果，M為DL2000 marker

圖2 TTCTB基因和GAPDH基因溶解曲線和擴增曲線

2.4 TTC7B基因蛋白表達量檢測 經(jīng)過蛋白質(zhì)免疫印跡檢測表明，內(nèi)參基因β-Actin條帶均一，蛋白表達量一致，說明總蛋白上樣量一致。而TTC7B基因在心梗組患者中表達水平高于冠心病組患者(如圖4)。

圖3 TTCTB基因的mRNA表達量 圖4 TTC7B基因的蛋白質(zhì)表達量

3 討論

本研究表明TTC7B基因在AMI患者外周血中表達量為SA組的3.24倍。同時，我們在蛋白表達水平也證實了該結(jié)果。與SA相比，TTC7B基因在AMI病人外周血中表達量增高，我們推測TTC7B基因可能參與了AMI的發(fā)病，在動脈粥樣硬化性心臟病由穩(wěn)定型心絞痛向急性心肌梗死轉(zhuǎn)變過程中起了作用。

一般認為，冠心病和急性心肌梗死為“同一種疾病”，表現(xiàn)為兩者均存在冠狀動脈狹窄，而急性心肌梗死是在冠心病基礎上發(fā)生的粥樣斑塊破裂或持續(xù)痙攣，堵塞冠脈造成遠端心肌的持續(xù)缺血、缺氧而發(fā)生壞死，常可導致惡性心血管事件發(fā)生，其致死率高。急性心肌梗死是冠心病最嚴重的臨床表型，兩者之間有著共同的危險因素,如糖尿病、高膽固醇血癥、高血壓、BMI、吸煙、肥胖、高脂飲食等[11]，這些危險因素對CAD和AMI的發(fā)病起了重要作用。然而，本研究中的2組病人性別、年齡、體重指數(shù)(BMI)、吸煙史、飲酒史、膽固醇水平、甘油三酯水平、低密度脂蛋白水平、高密度脂蛋白水平以及是否合并高血壓病、是否合并糖尿病均無顯著差異(P>0.05)。因此，可以明確，TTC7B基因獨立于上訴已知危險因素，可能是AMI發(fā)病的又一獨立危險因素。我們可以合理推測，TTC7B基因?qū)跔顒用}粥樣硬化性心臟病由SA向AMI轉(zhuǎn)變起了作用，因此，該基因可能作為評估AMI發(fā)病的基因危險因素。

全基因組關聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，TTC7B基因在心腦血管疾病的發(fā)生過程中存在重要的作用，在葡萄牙人和西班牙人的缺血性中風群體中，TTC7B基因第5、6內(nèi)含子中單堿基突變的頻率相對較高[12]。也有研究表明，TTC7B基因的甲基化會加速機體老化，從而引起心血管機能的退化[13]。CHIKV會導致少數(shù)患者出現(xiàn)腦膜腦炎、心肌炎及皮膚黏膜出血等癥狀，TTC7B與CHIKV蛋白的結(jié)合會有效的提高CHIKV的作用效率[14]。

Otowa T等研究發(fā)現(xiàn)，TTC7B基因在焦慮癥的發(fā)生過程中可能存在調(diào)節(jié)作用[15]，而焦慮癥是導致冠心病發(fā)生的重要因素之一[16]。然而，本研究所選病人均未行心理檢測，尚不能明確是否因為焦慮導致了AMI的發(fā)病。

在對正常小鼠與肥胖性小鼠模型的比較中得知，TTC7B基因在兩種動物模型中的表達量差異性顯著，從而表明TTC7B基因可能是肥胖病發(fā)生的一個重要的調(diào)節(jié)因子，并且在導致肥胖發(fā)生的同時也會引起血管內(nèi)皮生成發(fā)生變化，最終導致肥胖病人血管疾病的發(fā)生[17]。肥胖是心血管疾病的危險因素之一，對心血管事件的發(fā)生起了重要作用。本研究中的病人BMI基線值無顯著差異，因此，TTC7B基因促使SA向AMI轉(zhuǎn)變過程的機制，與其影響肥胖的機制可能無關。

TTC7B是TPR基因家族中的一員。TPR是由34個氨基酸組成的重復序列，其結(jié)構(gòu)域常形成螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)，并在其內(nèi)部形成空隙[18，19]。這些TPR結(jié)構(gòu)一般作為大分子復合物蛋白相互作用的組件，并涉及到多種細胞生物學過程，如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、mRNA修飾、蛋白折疊及轉(zhuǎn)移等[20]。然而，目前為止TTC7B的功能尚不明確。

在本研究中，我們首次發(fā)現(xiàn)在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中，TTC7B基因在SA和AMI均有表達，但與SA相比，TTC7B基因在AMI組表達升高，我們合理推測TTC7B基因參與了AMI的發(fā)病。然而，TTC7B基因?qū)е翧MI發(fā)病是否合并上述機制尚不得知，因此，對TTC7B基因進一步研究尤為必要。

致謝：我們衷心感謝吉林大學畜牧獸醫(yī)學院趙志輝教授和他的研究團隊對本實驗的技術指導。

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2008年教育部新世紀優(yōu)秀人才、2004年度吉林省杰出青年科學研究計劃、吉林省科技廳項目(20090734)、吉林省財政廳項目(2012009)

1007-4287(2016)10-1723-04

2015-08-17)

*通訊作者