李時(shí)孟,何成彥,謝 風(fēng),高 申*,楊照微,郭宏華,黃麗紅

(吉林大學(xué)中日聯(lián)醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科；2.消化內(nèi)科；3.老年病科，吉林 長(zhǎng)春130033)

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CKB在大腸癌中的表達(dá)及意義

李時(shí)孟1,何成彥1,謝 風(fēng)1,高 申1*,楊照微1,郭宏華2,黃麗紅3

(吉林大學(xué)中日聯(lián)醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科；2.消化內(nèi)科；3.老年病科，吉林 長(zhǎng)春130033)

目的 探討腦肌酸激酶(Creatine kinase B-type，CKB)在大腸癌組織中的表達(dá)水平及臨床意義。方法 應(yīng)用二維色譜及質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析18例大腸癌患者腫瘤標(biāo)本，篩選出在大腸癌腫瘤組織和癌旁組織差異表達(dá)的蛋白CKB，免疫印跡技術(shù)加以印證。結(jié)果 質(zhì)譜鑒定顯示CKB在腫瘤組織中較癌旁組織低表達(dá)，免疫印跡印證了其準(zhǔn)確性。結(jié)論 CKB的低表達(dá)在調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到一定作用。

腦肌酸激酶；大腸癌；液質(zhì)聯(lián)用

(ChinJLabDiagn,2016,20:1646)

腦肌酸激酶(Creatine kinase B-type，CKB)是一類在細(xì)胞質(zhì)中調(diào)控能量代謝的酶，國(guó)內(nèi)外有學(xué)者指出CKB與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[1-7]。本文采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)及免疫印跡技術(shù)，旨在研究CKB在大腸癌及癌旁組織中的差異表達(dá)及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集 共收集結(jié)直腸科手術(shù)切除的18例新鮮的組織標(biāo)本。以上標(biāo)本經(jīng)病理學(xué)診斷均為DukesB期腺癌。所有患者手術(shù)前均未接受輔助放化療。手術(shù)中獲得的癌旁正常組織距癌邊緣大于10厘米，且均取自癌組織上端。待標(biāo)本離體后，立即取材，液氮速凍，-80℃保存。

1.2 相關(guān)儀器及試劑 液相色譜分析儀由安捷倫公司提供，LTQXL離子肼質(zhì)譜儀由賽默飛世爾公司提供。蛋白質(zhì)定量試劑盒(RCDC Protein Assay Kit)購(gòu)于Bio-Rad公司。DNA酶和RNA酶均購(gòu)自 Sigma 公司。DTT及TPCK修飾所用的測(cè)序級(jí)胰酶購(gòu)自Promega公司。實(shí)驗(yàn)用水均由 Milli-Q 超純水發(fā)生裝置產(chǎn)生，電阻率保持在18 MΩ·cm。

1.3 方法

1.3.1 總蛋白提取和蛋白濃度檢測(cè) 將組織樣品從-80℃冰箱中取出，加入液氮研磨粉碎。每100 mg組織中加裂解緩沖液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%(w/v)3 -[(3 -膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸，25 mmol/L精胺，2 mmol/L苯甲基磺酰氟 ，65 mmol/L DTT)200 μl，室溫下振蕩1 h，并加入DNA酶和RNA酶用以去除DNA和RNA。10℃，100,000 g，離心1 h，吸取上清備用。用考馬斯亮藍(lán)染色，在595 nm條件下應(yīng)用核酸蛋白分析儀測(cè)吸光度，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法得出各組蛋白濃度，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 蛋白水解多肽混合物制備 取出-80℃保存的蛋白質(zhì)樣品，平衡室溫，取3倍體積的25 mmol/L NH4HCO3對(duì)樣品進(jìn)行稀釋，調(diào)整尿素濃度低于2 mol/L。加入1 mol/L DDT混勻使其終濃度控制在20 mmol/L，置于56℃條件下還原1 h，待反應(yīng)物降至室溫，加1 mol/L碘乙酰胺，調(diào)整終濃度至50 mmol/L，常溫條件下避光30 min。按1∶50比例加入測(cè)序級(jí)胰酶，放入37℃水浴箱中過(guò)夜，酶切產(chǎn)物，真空抽干后-80℃保存。

1.3.3 二維色譜和質(zhì)譜聯(lián)用分離及鑒定多肽混合物 取出上述樣品于0.1%甲酸中溶解，每次實(shí)驗(yàn)取50 μg樣品上樣，行二維液質(zhì)聯(lián)用分析，多肽經(jīng)反相色譜洗脫后，應(yīng)用LTQ XL質(zhì)譜儀檢測(cè)，質(zhì)核比檢測(cè)在400-2000 amu范圍內(nèi)。對(duì)強(qiáng)度大于10個(gè)單位或有10個(gè)以上離子信號(hào)的譜圖，進(jìn)一步進(jìn)行SEQUEST算法并用Bioworks 3.3.1 SP1軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，鑒定相關(guān)的多肽及蛋白。進(jìn)行鑒定的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)是從歐洲生物信息學(xué)院網(wǎng)站(http://www.ebi.ac.uk/IPI/)中下載的人蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(3.51版) 。

1.3.4 免疫印跡分析 在樣品中加入等量 2×載樣液，100℃條件下煮沸5 min，常溫10 000 r/min離心5 min。取20 μl上清液加入至10% SDS-PAGE，恒壓 200 V電泳40 min。將凝膠放在0.025% 考馬斯亮藍(lán)R-250染液中震蕩染色1 h，后在7%乙酸，50% 甲醇的水溶液中脫色1 h，再置于20% 甲醇，5% 甘油中過(guò)夜，用醋酸玻璃紙干燥備用。將凝膠切膠后平放于纖維素膜上進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，電流設(shè)定為100 mA轉(zhuǎn)移1 h。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，沖洗轉(zhuǎn)移膜再放入2%BSA封閉液中1h，沖洗兩次，將轉(zhuǎn)移膜與5 μl /ml 濃度的一級(jí)抗體加入雜交袋振搖1 h。洗膜后加入二級(jí)抗體反應(yīng)1小時(shí)。再次洗膜后，加底物反應(yīng)5 min即可。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤組織和癌旁組織中總蛋白酶解混合物的二維色譜及質(zhì)譜聯(lián)用分析結(jié)果 在腫瘤組織酶解混合物的多肽質(zhì)譜數(shù)據(jù)中，共鑒定了29 825個(gè)多肽序列，得出860個(gè)蛋白質(zhì)鑒定數(shù)據(jù)。在癌旁組織的多肽質(zhì)譜數(shù)據(jù)中，共鑒定了40 388個(gè)多肽序列，得出549個(gè)蛋白質(zhì)鑒定數(shù)據(jù)。

2.2 腫瘤組織和癌旁組織中差異蛋白質(zhì)譜分析 在差異蛋白鑒定中，譜圖數(shù)據(jù)需同時(shí)滿足兩樣品比值≥1及兩樣品差值≥72，為避免假陽(yáng)性的發(fā)生，每種樣品均行三次實(shí)驗(yàn)而后將三組結(jié)果比較分析。共得到44個(gè)差異蛋白，其中21個(gè)上調(diào)蛋白，23個(gè)下調(diào)表達(dá)。CKB質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 CKB質(zhì)譜圖

2.3 CKB免疫印跡結(jié)果

免疫印跡試驗(yàn)證實(shí)CKB在癌組織中表達(dá)下調(diào)，而在癌旁組織中高表達(dá)，見(jiàn)圖2。

圖2 CKB免疫印跡圖

3 討論

大腸癌發(fā)病隱匿，初期無(wú)典型臨床表現(xiàn)，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已進(jìn)入中晚期，即便手術(shù)治療并輔以放化療，大腸癌的5年生存率僅為50%[7]。因此，早期診斷仍為大腸癌的研究重點(diǎn)。隨著檢驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)可用于分析蛋白質(zhì)的組成、表達(dá)水平及修飾狀態(tài)，通過(guò)比較腫瘤組織與癌旁組織的差異蛋白表達(dá)，可發(fā)現(xiàn)高靈敏度、高特異性的腫瘤標(biāo)志物[8]。

在脊椎動(dòng)物的細(xì)胞中，肌酸激酶( creatine kinase，CK)是一類很重要的激酶，它可以精確地調(diào)節(jié)體內(nèi)能量平衡，維持細(xì)胞內(nèi)ATP水平穩(wěn)定[9]。CKB是肌酸激酶的一個(gè)亞型，廣泛存在于骨骼肌、心肌、神經(jīng)組織及線粒體中，參與能量信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，可逆性地催化磷酸肌酸的高能磷酸鍵與ADP結(jié)合而生成ATP和肌酸[10]。很多學(xué)者針對(duì)CKB在腫瘤發(fā)生及腫瘤進(jìn)展中所參與的能量代謝途徑進(jìn)行研究，Loo[11]等的研究表明CKB的高表達(dá)是大腸癌肝內(nèi)轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一，他指出在肝細(xì)胞內(nèi)的乏氧微壞境中，CKB在 miR-483 及miR-551a的調(diào)控下催化磷酸肌酸轉(zhuǎn)變?yōu)锳TP，為擴(kuò)散至肝臟的腫瘤細(xì)胞供能。Ruginis[12]等在研究中發(fā)現(xiàn)胃泌素釋放肽(Gastrin-releasing peptide，GRP)及其受體(GRPR)在大腸癌中異常高表達(dá)，而在表達(dá)GRP/GRPR的細(xì)胞系中CKB顯著低表達(dá)，考慮CKB可縮短腫瘤細(xì)胞的生存期。此外，在肺鱗癌、腎癌及膠質(zhì)瘤中均有研究顯示CKB為下調(diào)表達(dá)[10，13，14]。而Zeng[15]等在對(duì)肺鱗癌的研究中得到了不同的結(jié)果，CKB在腫瘤組織中顯著上調(diào)并可作為早期診斷的新型腫瘤標(biāo)志物。Chen[16]等和Li[9]等的研究也分別指出CKB在前列腺癌及卵巢癌中均為上調(diào)蛋白。

在本研究中，CKB在大腸癌組織中顯著下調(diào)表達(dá)，隨后進(jìn)行的免疫印跡試驗(yàn)也證實(shí)了CKB在癌組織中下調(diào)表達(dá)，而在癌旁組織中高表達(dá)。在以往的研究中，CKB已在多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)。雖然表達(dá)結(jié)果并不一致，但足以說(shuō)明CKB在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到一定的作用，但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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Creatine kinase B-type Expression in Colorectal Carcinoma and its Clinical Significance

LIShi-meng,HECheng-yan,XIEFeng,etal.

(DepartmentofClinicalLaboratory,China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Objective To detect the expression of creatine kinase B-type(CKB) in colorectal carcinoma and its clinical significance.Methods Samples of 18 patients with colorectal carcinoma were analyzed using two-dimensional chromatography and mass spectrometry technology to find differentially-expressed protein peaks including CKB,then CKB was tested by Western blotting.Results Identifications by mass spectrometer showed that CKB in adjacent tissues was significantly higher than that in colorectal carcinoma tissues,we also use Western blotting to conform the results.Conclusion The low expression of CKB is closely related with oncogenesis and progression of colorectal carcinoma.

Creatine kinase B-type(CKB);colorectal carcinoma;LC-MS

國(guó)家自然科學(xué)基金(81572082)；吉林省科技廳基金(20140311092YY，20150101153,20150414015)

1007-4287(2016)10-1646-03

R735.3+4

A

2015-07-23)

*通訊作者