尹天泉，張 米，何新華

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院 急診科，北京100020)

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氬氦刀治療小鼠肺腺癌后瘤周注射樹突狀細(xì)胞對冷凍免疫效應(yīng)的影響

尹天泉，張 米，何新華

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院 急診科，北京100020)

目的 探討氬氦刀治療小鼠肺腺癌后，在瘤體周圍注射樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)是否可提高冷凍免疫效應(yīng)。方法 38只T739荷瘤小鼠(LA795肺腺癌，瘤體位于右后肢皮下，直徑7±0.5 mm)隨機(jī)分成2組(19只/組)。實驗組:雙循環(huán)氬氦冷凍消融后于瘤周注射DCs；對照組:雙循環(huán)氬氦冷凍消融。術(shù)后第3、7、14d脫頸處死小鼠，眼眶采血(3只/組/時間點)，流式細(xì)胞術(shù)微球陣列法檢測細(xì)胞因子IL-12，IFN-γ,IL-4，IL-10濃度；流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+T、CD8+T細(xì)胞比例；每組10只小鼠用于觀察生存時間。結(jié)果 實驗組在各時間點IL-12、IFN-γ濃度均高于對照組，IL-4、IL-10濃度均低于對照組；實驗組CD4+T細(xì)胞比例在各時間點均高于冷凍治療組，CD8+T細(xì)胞在術(shù)后第7、14 d均高于對照組。以上所有差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在術(shù)后第3 d，實驗組CD8+T細(xì)胞比例高于對照組，但其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。實驗組生存率高于對照組，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 氬氦冷凍消融術(shù)后在瘤周注射DCs可顯著提高冷凍治療的抗腫瘤免疫效應(yīng)，并延長生存時間。

氬氦冷凍消融；肺腺癌；冷凍免疫效應(yīng)；樹突狀細(xì)胞

(ChinJLabDiagn,2016,20:1631)

肺癌是目前世界上發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤。其中腺癌所占比例在近30年來有一定的上升趨勢[1]。由于早期診斷不足，多數(shù)患者就診時已喪失手術(shù)機(jī)會。氬氦靶向冷凍消融系統(tǒng)(簡稱氬氦刀)的出現(xiàn)為減輕晚期肺癌患者的腫瘤負(fù)荷、延長患者生存期提供了新的手段。氬氦冷凍消融是利用Joule-Thompson效應(yīng)，使組織在60秒內(nèi)迅速降至-140℃左右，從而使組織發(fā)生凝固性壞死的微創(chuàng)治療方法。目前已廣泛應(yīng)用于肺癌、肝癌、前列腺癌、腎癌、乳腺癌、骨腫瘤等實體瘤的治療[2-8]。由于壞死腫瘤組織滯留體內(nèi)并釋放腫瘤相關(guān)抗原(tumor associated antigens,TAAs)及腫瘤特異性抗原(tumor specific antigens,TSAs)，氬氦冷凍消融還具有激發(fā)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)的潛能(即冷凍免疫效應(yīng))，因此，有學(xué)者認(rèn)為冷凍治療同時也是一種免疫治療[9]。大量實驗室及臨床研究表明冷凍治療后機(jī)體內(nèi)可檢測到抗腫瘤免疫反應(yīng)的發(fā)生。然而，單純依靠冷凍免疫效應(yīng)對抗腫瘤的復(fù)發(fā)及殘余瘤的消除，臨床上并未取得顯著的治療效果。本研究旨在探討氬氦冷凍消融治療肺腺癌后，在瘤周注射DCs是否可增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

1 材料和方法

1.1 T739小鼠LA795肺腺癌模型的建立

LA795肺腺癌細(xì)胞系(由協(xié)和醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所提供)復(fù)蘇后，于含10% 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，胰酶收獲后，PBS重懸制備細(xì)胞懸液，按5×105/0.2 ml/只，接種于6W齡T739小鼠(海軍總醫(yī)院動物實驗中心提供)右后肢背側(cè)皮下。1W后瘤體直徑增至7±0.5 mm時用于實驗。

1.2 DCs的培養(yǎng)

DCs的培養(yǎng)參照文獻(xiàn)方法并加以改進(jìn)[10]。取健康6W齡T739小鼠股骨和脛骨骨髓細(xì)胞，過篩后，培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，按1 000 U/mL濃度分別加入重組小鼠粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rmGM-CSF，R&D)和重組小鼠白細(xì)胞介素4(rmIL-4,R&D)，隔日加入等量的rmGM-CSF和rmIL-4，培養(yǎng)7天后收集備用。

1.3 分組及治療方法

1.3.1 分組 38只荷瘤小鼠隨機(jī)分成2組，每組19只。實驗組：雙循環(huán)氬氦冷凍消融術(shù)后在冷凍區(qū)邊緣外側(cè)注射DCs；對照組：只進(jìn)行雙循環(huán)氬氦冷凍消融治療。

1.3.2 氬氦冷凍消融腫瘤 10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠(0.2 ml/只)，固定后，備皮，消毒，采用氬氦冷凍消融設(shè)備(美國Endocare公司)實行冷凍手術(shù)。將2 mm氬氦刀冷凍刀頭，插入腫瘤中央，采用雙循環(huán)冷凍方法：溫度降低至-120℃，冷凍10 s，復(fù)溫至0℃，再次重復(fù)上述凍融循環(huán)。

1.3.3 DCs的注射 離心法收集DCs，PBS洗滌三次后調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/ml,1 ml注射器抽取0.2 ml細(xì)胞懸液，注射于冷凍區(qū)邊緣外側(cè)皮下(2×105/只)。

1.4 取材及檢測

1.4.1 取材 于治療后第3、7、14 d取材， 3只/組/時間點，脫頸法處死小鼠，眼眶采血，每組10只用于觀測生存時間。

1.4.2 流式細(xì)胞術(shù)微球陣列法檢測細(xì)胞因子IL-12、IFN-γ、IL-4、IL-10濃度 Cytometric Bead Array(CBA) Flex Set IL-12、IFN-γ、IL-4、IL-10試劑盒均為美國BD公司產(chǎn)品，按照試劑盒說明進(jìn)行稀釋、孵育。FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(BD公司)，BD CBA軟件進(jìn)行分析。具體方法參考文獻(xiàn)[11]。

1.4.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測血CD4+T及CD8+T細(xì)胞 小鼠抗體CD4-FITC、CD8a-PE及CD3e-PerCP均購于美國BioLegend公司，按試劑說明進(jìn)行操作，采用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD公司)進(jìn)行檢測。

1.5 生存時間

以治療當(dāng)天為第0天，按小鼠自然死亡時間記錄生存時間并進(jìn)行生存分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

GraphPad 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析及作圖。組間比較采用t檢驗，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。生存分析采用Kaplan-Meier曲線及Log- Rank法檢驗。

2 結(jié)果

2.1 血IL-12，IFN-γ,IL-4，IL-10濃度比較

如表1所示，在各時間點實驗組IL-12、IFN-γ濃度均高于對照組，其差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在各時間點實驗組IL-4，IL-10濃度均低于對照組，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 血CD4+T,CD8+T細(xì)胞比較

如表2所示，在各時間點實驗組CD4+T細(xì)胞比例均高于對照組(P<0.05)；在術(shù)后第3 d，實驗組CD8+T細(xì)胞比例高于對照組，但其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在術(shù)后第7、14 d，實驗組CD8+T細(xì)胞比例高于對照組，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 生存分析

如圖1所示，實驗組小鼠生存率顯著高于對照組，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

冷凍免疫效應(yīng)的提出緣于Soanes等人在前列腺癌患者身上發(fā)現(xiàn)冷凍治療原發(fā)病灶后，其肺部轉(zhuǎn)移瘤可縮小[12]。其后大量的研究證實了冷凍免疫效應(yīng)的存在，然而，也有一些實驗沒有觀察到明顯的冷凍免疫效應(yīng)，甚至還有少數(shù)研究者認(rèn)為冷凍具有免疫抑制效應(yīng)[13-15]。機(jī)體的抗腫瘤免疫效應(yīng)主要是通過腫瘤特異性的CTLs實現(xiàn)的。冷凍抗腫瘤免疫效應(yīng)的成功誘導(dǎo)應(yīng)包括以下幾個環(huán)節(jié)：(1)腫瘤抗原(腫瘤相關(guān)抗原/腫瘤特異性抗原)的充分釋放；(2)抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cells,APCs)對抗原的攝取及提呈；(3)初始Th淋巴細(xì)胞的激活；(4)腫瘤特異性 CTLs的活化。其中APCs是連接冷凍治療及免疫反應(yīng)的橋梁，而DCs是體內(nèi)抗原提呈功能最強(qiáng)大的APCs，也是唯一能夠激活初始Th淋巴細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞。有研究表明，腫瘤的發(fā)展與瘤體周圍浸潤性DCs的數(shù)量減少及功能下降相關(guān)[16]。由于冷凍治療后滯留體內(nèi)的壞死腫瘤組織可提供充足的腫瘤抗原，因而，不同患者(或?qū)嶒瀯游?自身DCs的數(shù)量及功能差異，是產(chǎn)生冷凍免疫效應(yīng)差異的重要因素之一。Machlenkin A等應(yīng)用液氮冷凍治療聯(lián)合瘤體內(nèi)注射DCs，有效提高了小鼠的抗腫瘤免疫反應(yīng)，本實驗得到了與其相一致的結(jié)果[17]。為了充分模擬目前的臨床治療模式，本實驗采用了雙循環(huán)氬氦冷凍消融治療；DCs的注射位點選取了瘤體周圍，一方面考慮接近抗原釋放位置，另一方面考慮瘤體外未壞死的組織利于DCs在體內(nèi)的存活及歸巢。本實驗通過對細(xì)胞因子及T細(xì)胞亞型的檢測，證實該方法可顯著提高Th1型細(xì)胞因子的分泌及CTLs的比例。生存分析顯示實驗組動物的生存時間顯著延長，提示該方法具有臨床應(yīng)用的潛在價值。進(jìn)一步的研究應(yīng)致力于DCs在體內(nèi)的存活、歸巢及功能狀態(tài)的研究。此外，最小及最佳 DCs注射數(shù)量及其相關(guān)因素的研究，可為該方法走上臨床應(yīng)用提供重要實驗數(shù)據(jù)。

表1 血細(xì)胞因子濃度(pg/mL)

*P<0.05**P<0.01***P<0.001

表2 血T細(xì)胞亞型比例(%)

*P<0.05**P<0.01

圖1 Kaplan-Meier曲線：Log- Rank法檢驗實驗組

[1]朱元玨，陳文彬.呼吸病學(xué)[M].第1版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：1011-70.

[2] Lizhi Niu,Kecheng Xu,Feng，et al.Cryosurgery for lung cancer[J].Journal of Thoracic Disease,2012,4:408.

[3]李 征，米登海，楊克虎,等.肝動脈化療栓塞術(shù)聯(lián)合氬氦刀治療肝癌療效及安全性的系統(tǒng)評價[J].中國循證醫(yī)學(xué)雜志，2013,1:31.

[4]Liu YY,Chiang PH.Comparisons of Oncological and Functional Outcomes Between Primary Whole-Gland Cryoablation and High-Intensity Focused Ultrasound for Localized Prostate Cancer[J].Ann Surg Oncol,2016，23(1)：328.

[5]Zargar H,Atwell TD,Cadeddu JA，et al.Laparoscopic Cryoablation for Renal Cell Carcinoma:100-Month Oncologic Outcomes-A Single Institution Experience[J].J Urol,2015,23(15):03851.

[6]Panizza PS,de Albuquerque Cavalcanti CF，Yamaquchi NH,et al.Percutaneous CT-Guided Cryoablation as an Alternative Treatment for an Extensive Pelvic BoneGiant Cell Tumor[J].Cardiovasc Intervent Radiol,2016,39(2):299.

[7]Sabel MS,Nehs MA,Su G,et al.Immunologic response to cryoablation of breast cancer [J].Breast Cancer Res Treat,2005,90(1):97.

[8]de Baere T,Tselikas L,Woodrum D，et al.Evaluating Cryoablation of Metastatic Lung Tumors in Patients-Safety and Efficacy:The ECLIPSE trial-Interim analysis at 1-Year[J].J Thorac Oncol,2015,10(10):1468.

[9] Sidana A.Cancer immunotherapy using tumor cryoablation[J].Immunotherapy,2014,6(1):85.

[10]Koji Teramoto,Yasuhiko Ohshio,Takuya Fujita,et al.Simutaneous activation of T helper function can augment the potency of dendritic cell-based cancer immunotherapy [J].J Cancer Res Clin Oncol,2013,139:861.

[11]李冰雪，段新亞，李明武，等.流式微球陣列法檢測肺結(jié)核患者血清部分細(xì)胞因子的臨床意義[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2012,28(3):297.

[12]Ablin RJ,Soanes WA,Gonder MJ.Elution of in vivo bound antiprostatic epithelial antibodies following multiple cryotherapy of carcinoma of prostate [J].Urology,1973,2(3):276.

[13]Sabel MS.Cryo-immunology:A review of the literature and proposed mechanisms for stimulatory versus suppressive immune response[J].Cryobiology,2009,58(1):1.

[14]Ablin RJ.What of the clinical significance of the cryoimmune response[J].Dermatol Surg,1997,23(6):499.

[15]He XZ,Wang QF,Han S,et al.Cryo-ablation improves anti-tumor immunity through recovering tumor educated dendritic cells in tumor-draining lymph nodes[J].Drug Des Devel Ther,2015,9:1449.

[16]王 琪，林 蘋.腫瘤浸潤性樹突狀細(xì)胞的研究進(jìn)展[J].中國癌癥雜志,2005,2:185.

[17]Machlenkin A,Goldberger O,Tirosh B,et al.Combined dendritic cell cryotherapy of tumor induces systemic antimetastatic immunity[J].Clin Cancer Res,2005,11(13):4955.

Effect of Peri-tumoral Injection of Dendritic Cells Following Argon-Helium Crytherapy on Cryoimmune Response in the model of lung adenocarcinoma bearing mice

YINTian-quan,ZHANGMi,HEXin-hua.

(DepartmentofEmergency,BeijingChaoyangHospitalAfliatedtoCapitalMedicalUniversity,Beijing100020,China)

Objective To evaluate the effect of peri-tumoral injection of dendritic cells (DCs) following argon-helium cryoablation of lung adenocarcinoma on the cryoimmune response.Methods Thiety-eight LA795 lung adenocarcinoma bearing mice (tumor of 7±0.5mm in diameter was subcutaneous in the right hind femur) were randomly devided into 2 groups：experimental group(double-circled Argon-Helium cryoablation & peritumoral injection of DCs) and the control group(double-circled Argon-Helium cryoablation).Mice were excuted on day 3,7 and 14 after treatment (3mice/group/time point) for orbital blood sampling.Cytokines(IL-12，IFN-γ,IL-4，IL-10) and T lymphocyte subsets(CD4+T &CD8+T cells) in the blood were tested by Cytometric Bead Array(CBA) flow cytometry (FCM) respectively.Ten mice in each group were used to evaluate survival time.Results Compared with the control group,the experimental group has higher concentration of IL-12 and IFN-γ; while has lower concentration of IL-4 and IL-10 at each time point.Percentage of CD4+T cells in the experimental group was higher at each time point; percentage of CD8+T cells in the experimental group was higher on day 7 and 14.All of the differences have statistical significance (P<0.05) .On day 7 post treatment,the percentage of CD8+T cells in the experimental group was higher than that in the control group,while the difference showed no statistical significance (P>0.05).Survival time of the experimental group was longer than that of the control group，and the difference was statistically significant (P<0.05).Conclusion Peri-tumoral injection of DCs following cryotherapy can effectively enhance the anti-tumor croyimmune effect and thus prolong the life span.

Argon-helium cryoablation; Lung adenocarcinoma; Cryoimmune effect; Dendritic cell

1007-4287(2016)10-1631-04

R734.2

A

2015-05-29)