趙 鑫，常 穎，劉玉俠，趙 暉，盧衛(wèi)平，于 鴻，王啟文*

(1.吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130012；2.吉林省腫瘤防治研究所，吉林 長(zhǎng)春130012)

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*通訊作者

負(fù)載抗原的DC及DC-CIK對(duì)小細(xì)胞肺癌殺傷作用的比較研究

趙 鑫1，常 穎1，劉玉俠2，趙 暉1，盧衛(wèi)平1，于 鴻2，王啟文1*

(1.吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130012；2.吉林省腫瘤防治研究所，吉林 長(zhǎng)春130012)

目的 探討負(fù)載抗原的樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DC)以及DC聯(lián)合CIK細(xì)胞(cytokine induced killer cells)對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCIH-446的殺傷作用，為DC、CIK應(yīng)用于小細(xì)胞肺癌的治療提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。方法 體外培養(yǎng)DC、CIK細(xì)胞，并將NCIH-446提取的抗原負(fù)載到DC，同時(shí)將DC與CIK聯(lián)合培養(yǎng)，將負(fù)載抗原的DC(DC-Ag)及DC-CIK與NCI446按50∶1的比例進(jìn)行殺傷活性實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)培養(yǎng)不同時(shí)間的兩種細(xì)胞對(duì)NCIH-446的殺傷作用。結(jié)果 DC-Ag及DC-CIK在與NCIH-446CIK共同培養(yǎng)2個(gè)小時(shí)就監(jiān)測(cè)到了兩種細(xì)胞對(duì)NCIH-446的殺傷作用，而且隨著時(shí)間的推移，殺傷作用逐漸增強(qiáng)，DC-Ag從2小時(shí)的57.63%提高到48小時(shí)的90.78%，而DC-CIK從62.95%提高到了91.57%，顯示了兩種細(xì)胞強(qiáng)大的殺傷作用，而且這種作用隨著時(shí)間的延長(zhǎng)效果越明顯。結(jié)論 負(fù)載抗原的DC及DC-CIK對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCIH-446有極強(qiáng)的殺傷活性，為臨床小細(xì)胞肺癌的治療提供了一種新的方法。

樹(shù)突狀細(xì)胞；細(xì)胞因子活化殺傷細(xì)胞；小細(xì)胞肺癌，殺傷活性

(ChinJLabDiagn,2016,20:1627)

在肺癌的發(fā)病率中，小細(xì)胞肺癌所占的比例不是很高，大約13%左右[1]。但其生長(zhǎng)迅速，侵襲性要強(qiáng)于非小細(xì)胞肺癌，易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，生存期較短[1,2]。小細(xì)胞肺癌對(duì)化療極為敏感，據(jù)報(bào)道經(jīng)化療后的病人RR可達(dá)60%-90%，CR可達(dá)30%-40%[3],但極易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，所以如何預(yù)防化療后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，提高病人的生存期和生活質(zhì)量，是小細(xì)胞肺癌治療成功的關(guān)鍵，也是目前治療的難題。生物治療近年來(lái)以其對(duì)腫瘤的強(qiáng)大殺傷力以及對(duì)腫瘤病人免疫功能的恢復(fù)和提高效果被用于腫瘤的治療。本實(shí)驗(yàn)選擇生物治療中的DC負(fù)載抗原以及DC、 CIK聯(lián)合培養(yǎng)對(duì)小細(xì)胞肺癌進(jìn)行體外殺傷實(shí)驗(yàn)，為小細(xì)胞肺癌的治療提供一種除化療外的治療手段。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 淋巴細(xì)胞分離液 天津?yàn)笊镏破房萍钾?zé)任有限公司；GM-CSF，TNF-α，IL-4Peprotech公司;IMDM培養(yǎng)基GIBCO公司；胎牛血清天津康源公司； IL-2北京四環(huán)生物制藥有限公司；anti-CD3Ab Biolegend公司。anti-hunman CD3-FITC,anti-hunman CD16、CD56-PE購(gòu)自 BD公司；IFN-γ天津?yàn)笊镏破房萍钾?zé)任有限公司；CD3+、CD4+、NK、NKT、CD3+HLA-DR+、CD8+CD28+熒光標(biāo)記單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)BECKMAN COULTER公司。

1.1.2 小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCIH-446 吉林省腫瘤防治研究所保存。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀XCELLigence RTCA S16，E-Plate16細(xì)胞檢測(cè)板北京昊諾斯科技有限公司提供；低溫高速離心機(jī)SORVALL公司；HERA CEEL 240iCO2培養(yǎng)箱Thermo Scientific公司；流式細(xì)胞儀BD公司。

1.2 方法

培養(yǎng)NCIH-446細(xì)胞：將凍存的NCIH-446細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用0.25%胰酶進(jìn)行消化后，調(diào)細(xì)胞數(shù)為6×104/ml,備用。首先將E-Plate16細(xì)胞檢測(cè)板中加50 μl培養(yǎng)液測(cè)量基線，然后再加已調(diào)好細(xì)胞數(shù)的NCIH-446，100 μl/孔，放入xCELLigence RTCA S16實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀中，并將其放到37℃，5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)24小時(shí)。效應(yīng)細(xì)胞DC、CIK的制備及鑒定，見(jiàn)參考文獻(xiàn)[4,5]。NCIH-446腫瘤抗原的制備見(jiàn)參考文獻(xiàn)[6]。將培養(yǎng)6天的DC加入NCIH-446提取的抗原[5]與DC-CIK按1∶1的比例共同培養(yǎng)3天，分別調(diào)細(xì)胞數(shù)為3×106/ml，備用。將加入NCIH-446的E-Plate16細(xì)胞檢測(cè)板從37℃，CO2培養(yǎng)箱中取出，按以下設(shè)計(jì)加入已調(diào)好細(xì)胞數(shù)的負(fù)載抗原的DC及DC-CIK細(xì)胞，每孔100 μl，放入xCELLigence RTCA S16實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀中，再將其放回到37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，對(duì)殺傷活性進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。本實(shí)驗(yàn)共監(jiān)測(cè)了48小時(shí)，每15分鐘監(jiān)測(cè)1次。分三組，第1組:NCIH-446； 第2組:DC-Ag+NCIH-446(50∶1)；第3組;DC-CIK+NCIH-446(50∶1)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

DC-Ag、DC-CIK對(duì)NCIH-446的殺傷效應(yīng)的監(jiān)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。整個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了72小時(shí)，其中殺傷實(shí)驗(yàn)從24小時(shí)開(kāi)始進(jìn)行，共進(jìn)行了48小時(shí)。從圖中可以看出，DC-Ag、DC-CIK與NCIH-446共培養(yǎng)后NCIH-446的CI迅速下降，并且一直維持到本實(shí)驗(yàn)結(jié)束。從監(jiān)測(cè)的結(jié)果中選取了以上的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，見(jiàn)表1。結(jié)果證明DC-Ag及DC-CIK對(duì)NCIH-446的殺傷效應(yīng)從2小時(shí)開(kāi)始顯現(xiàn)，而且隨著時(shí)間的推移，殺傷效果不斷提高，到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)最高達(dá)都達(dá)到90%，而且6小時(shí)，13小時(shí)，24小時(shí)35小時(shí)，48小時(shí)DC-CIK及DC-Ag 與2小時(shí)的殺傷活性比有明顯差異(P<0.01)，而DC-CIK與DC-Ag相比在同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)NCIH-446的殺傷效應(yīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有差異。

紅色為NCIH-446，綠色為DC-Ag+NCIH-446，藍(lán)色為DC-CIK+NCIH-446

3 討論

小細(xì)胞肺癌在肺癌的發(fā)病率中雖然不是很高，但是其發(fā)展速度快，侵襲性強(qiáng)，治療后的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率高，因此預(yù)后往往很差。雖然化療對(duì)小細(xì)胞肺癌的治療可以快速起效，但其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移速度也較其它類(lèi)型肺癌快，嚴(yán)重影響了它的預(yù)后和生存期。目前生物治療在腫瘤的綜合治療中發(fā)揮著重要作用，它可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞，提高免疫功能，尤其對(duì)清除放化療后殘存的腫瘤細(xì)胞[7]，預(yù)防轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)具有較好的作用。

樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DC)是目前發(fā)現(xiàn)功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞，可以激活CD8+T殺傷細(xì)胞以及CD4+T輔助細(xì)胞，在免疫應(yīng)答反應(yīng)中起著重要作用[8]。CIK是一種廣譜的抗腫瘤細(xì)胞，它具有殺傷性強(qiáng)，無(wú)MHC限制的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)選用抗原負(fù)載的DC(DC-Ag)及DC聯(lián)合CIK對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCIH-446進(jìn)行殺傷活性實(shí)驗(yàn)，通過(guò)xCELLigence RTCA S16實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，結(jié)果證明，DC-Ag 、DC-CIK與NCIH-446在效靶比為50:1時(shí)，在共同培養(yǎng)2小時(shí)時(shí)就產(chǎn)生了較強(qiáng)的殺傷效果，而且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，殺傷效果不斷提高(見(jiàn)圖1，表1)，維持了對(duì)腫瘤殺傷的持續(xù)效應(yīng)，兩種細(xì)胞在培養(yǎng)48小時(shí)殺傷率都達(dá)到了90%以上，證明了抗原負(fù)載的DC及DC聯(lián)合CIK對(duì)小細(xì)胞肺癌強(qiáng)大的殺傷活性。但在同一時(shí)間點(diǎn)兩種細(xì)胞對(duì)NCIH-446的殺傷作用沒(méi)有明顯差異。

表1 DC-Ag、DC-CIK對(duì)NCIH-446的殺傷效應(yīng)

※P<0.01,與2小時(shí)相比，△P<0.01與2小時(shí)相比

[1]Van Meerbeeck JP,Fennell DA,De Ruysscher DK.Small- cell lung cancer[J].Lancet,2011,378(9804):1741.

[2]Dooley AL,Winslow MM,Chiang DY,et al.nuclear factor I/B is an oncogene in small cell lung cancer[J].Genes Dev,2011,25(14):1470.

[3]廖美琳，王慧敏.小細(xì)胞肺癌的治療進(jìn)展[J].腫瘤，2001,21(6)：399.

[4]趙 鑫，常 穎，劉玉俠，等.培養(yǎng)不同時(shí)間CIK細(xì)胞免疫表型變化與其抗腫瘤活性關(guān)系的研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2015,19(9)：1455.

[5]于 鴻，劉玉俠．熱休克蛋白抗原肽致敏的臍血樹(shù)突狀細(xì)胞治療肺癌的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2007,2(35)：18.

[6]于 鴻，張 健，劉玉俠，等.抗原致敏的臍血樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)抗腫瘤效應(yīng)的體外實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2010,14(1)：107.

[7]劉清池，張慧敏，張玉娜，等.DC-CIK細(xì)胞清除微小殘留白血病的臨床研究[J].中國(guó)腫瘤生物治療雜志，2013,20(4)：398.

[8]Gilboa E.DC-based cancer vaccines[J].J China Invest,2007,117:1195.

The compare study of antigen-pulsed DC and DC united CIK on Small cell lung cancer

ZHAOXin,CHANGHing,LIUYu-xia,etal.

(JilinProvinceTumorHospital,Changchun130012，China)

Objective Investigate the killing effect which antigen-pulsed Dendritic cells(Dendritic cells,DC)and DC united CIK cells(cytokine induced killer cells)have on small cell lung cancer cell lines NCIH-446 and provide the experimental data for the DC,CIK used in the treatment of small cell lung cancer.Methods Culture the DC,CIK cells in vitro,load the antigen extracted from NCIH-446 to DC,co-culture DC and CIK at the same time,do the experiment of killing activity making the antigen-pulsed DC(DC-ag)and DC-CIK in a 50:1 properation with NCIH-446,detective killing effect of two cells in different culture time on NCIH-446.Results The killing effect which DC-Ag and DC-CIK have on NCIH-446 can be surveyed after 2 hours' co-culture and the killing effect increases gradully over time,DC-Ag increases from 57.63% to 90.78% within 46 hours and DC-CIK increases from 62.95% to 91.57%,which shows the great killing effect of the two cells,the effect becomes more obvious over time.Conclusion Antigen-pulsed DCs and DC-CIK have strong killing activity on small cell lung cell line NCIH-446,which provides a new method for the clinical treatment of small cell lung cancer.

dendritic cells;cytokine activated killer cells;small cell lung cancer;killing activity

1007-4287(2016)10-1627-03

R734.2

A

2015-04-11)