黃 鶯，吳黎明，張 玲，張 恒，張晶晶，邵建偉，孫慶敏

(1.宜興人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，江蘇 宜興214211；2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 婦科)

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MACC1對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響

黃 鶯1，吳黎明1，張 玲1，張 恒1，張晶晶1，邵建偉1，孫慶敏2

(1.宜興人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，江蘇 宜興214211；2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 婦科)

目的 探討結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(MACC1)對(duì)宮頸癌細(xì)胞Hela侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及機(jī)制。方法 Western blot法檢測(cè)我院10例宮頸癌組織標(biāo)本和10例癌旁正常組織標(biāo)本中MACC1的表達(dá)，通過(guò)脂質(zhì)體將siRNA-MACC1轉(zhuǎn)入宮頸癌Hela細(xì)胞中，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，Transwell法檢測(cè)細(xì)胞和遷移侵襲能力，Western blot檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)及上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白表達(dá)量。結(jié)果 宮頸癌組織中的MACC1表達(dá)量高于癌旁正常組織(P<0.01)，通過(guò)脂質(zhì)體將siRNA-MACC1及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染到宮頸癌Hela細(xì)胞后，與對(duì)照組比較，siRNA-MACC1組中細(xì)胞活力下降，細(xì)胞遷移和侵襲能力下降(P<0.01)，MMP2，MMP9及波形蛋白(vimentin)表達(dá)量下調(diào)(P<0.01)，E-鈣粘蛋白(E-cadherin)表達(dá)量上調(diào)(P<0.01)。結(jié)論 MACC1表達(dá)下調(diào)能抑制宮頸癌Hela細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，與逆轉(zhuǎn)MMPs，EMT相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。

MACC1；宮頸癌；侵襲；轉(zhuǎn)移

(ChinJLabDiagn,2016,20:1623)

宮頸癌是最常見(jiàn)的女性生殖道惡性腫瘤，但隨著宮頸細(xì)胞學(xué)篩查體系的普及和完善，宮頸癌的發(fā)病率明顯的上升且趨于年輕化[1]。盡管目前臨床上主要采取治療為主，輔以放療或生物治療等多種治療相結(jié)合的方法已顯著降低了患者的死亡率，但宮頸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移、局部復(fù)發(fā)仍是絕大多數(shù)患者治療失敗的主要原因，是臨床上解決的難點(diǎn)[2]。

結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(metastasis-associated in colon cancer 1，MACC1)是由Stein等在2009年在結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)并命名，定位于人7號(hào)染色體上，編碼852個(gè)氨基酸，并且發(fā)現(xiàn)此蛋白與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移、預(yù)后密切相關(guān)[3]。MACC1在多種腫瘤中異常表達(dá)，且與癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4-7]。周娜等[4]通過(guò)免疫組化檢測(cè)中-重度宮頸上皮內(nèi)瘤變組織(CINⅡ-Ⅲ)，91例宮頸癌組織及10例正常宮頸組織，發(fā)現(xiàn)MACC1宮頸癌組織、CINⅡ-Ⅲ組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別依次為83.5%、76.5%、80.2%、70.6%，均顯箸高于正常宮頸組織，且與組織學(xué)分化程度、脈管浸潤(rùn)、肌層浸潤(rùn)深度與宮頸癌盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。說(shuō)明MACC1蛋白高表達(dá)是宮頸癌盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但具體機(jī)制未知，因此本研究通過(guò)干擾MACC1基因表達(dá)后轉(zhuǎn)染到宮頸癌Hela細(xì)胞中，探討其對(duì)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 收集2014年6月至2015年6月江蘇省宜興人民醫(yī)院外科手術(shù)切除的宮頸癌組織10例標(biāo)本及癌旁正常組織10例標(biāo)本。

1.2 主要試劑和儀器 宮頸癌Hela細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，目錄號(hào)TCHu187；兔抗MMP2，MMP9，E-cadherin，vimentin單克隆抗體(Epitmics公司)；兔抗MACC1單克隆抗體(Cell Signal Technology)；胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)；transwell 小室(Corning 公司)。迷你雙垂直電泳儀，迷你轉(zhuǎn)印電泳儀(北京六一儀器廠(chǎng))；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；

1.3 miRNA合成與轉(zhuǎn)染 在上海吉瑪制藥公司訂購(gòu)合成siRNA-MACC1:上游引物：5’-CACCCUUCGUGGUAAUAAUTT-3’，下游引物：5’-AUUAUUACCACGAAGGGUGTT-3’。陰性對(duì)照組上游引物：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3，下游引物：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)用品的不同以及上海吉瑪公司產(chǎn)品的操作說(shuō)明推薦siRNA-MACC1與LipofectamineTM2000的比例進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 將宮頸癌細(xì)胞Hela接種于96孔板，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)，用LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染siRNA-MACC1和陰性對(duì)照。48 h后，加入20 μl 5 mg/ml MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入150 μl DMSO，震蕩使結(jié)晶物充分溶解，于酶標(biāo)儀560 nm處測(cè)OD值。1.5 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 將宮頸癌細(xì)胞Hela接種于6孔板當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)，用LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染siRNA-MACC1和陰性對(duì)照，轉(zhuǎn)染達(dá)到48 h后，將細(xì)胞消化加入transwell上室，下室用含 5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出transwell小室，洗滌，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，倒置光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)視野穿膜細(xì)胞個(gè)數(shù)，計(jì)算平均每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)，即表示細(xì)胞的遷移能力。

1.6 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將Matrigel膠均勻平鋪于transwell 小室的微膜(5 μm)上，制成凝膠備用。其余步驟如1.5所示。計(jì)算平均每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)，即表示細(xì)胞的侵襲能力。

1.7 Western blot 在收集到的細(xì)胞中，加入適量的RIPA裂解液裂解可獲得總蛋白。根據(jù)BCA試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。蛋白上樣，跑SDS凝膠電泳，后濕法轉(zhuǎn)膜。一抗溶液孵育，4℃過(guò)夜；二抗溶液中室溫孵育1-2 h。將膜取出漂洗，在膜上滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用“Quantity one”軟件對(duì)各抗體條帶灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1MACC1在宮頸癌組織中的表達(dá)Westernblot證實(shí)宮頸癌組織中MACC1的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織的表達(dá)，其比值分別為(6.32±0.54)vs.(1.48±0.12)(P<0.01)。

2.2MACC1對(duì)宮頸癌細(xì)胞Hela活力的影響 與對(duì)照組比較，siRNA-MACC1組Hela細(xì)胞活力下降(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

與對(duì)照組比較，**P<0.01

2.3MACC1對(duì)宮頸癌細(xì)胞Hela遷移和侵襲能力的影響 如圖2，圖3所示，通過(guò)transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，siRNA-MACC1組中Hela細(xì)胞遷移和侵襲能力下降。

圖2 MACC1對(duì)宮頸癌細(xì)胞Hela遷移能力的影響

圖3 MACC1對(duì)宮頸癌細(xì)胞Hela侵襲能力的影響

2.4MACC1對(duì)宮頸癌細(xì)胞Hela中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，siRNA-MACC1組Hela細(xì)胞中MMP2，MMP9表達(dá)量下降(P<0.01)。見(jiàn)圖4。

2.5MACC1對(duì)宮頸癌細(xì)胞Hela中E-cadherin和vimentin表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，siRNA-MACC1組中Hela細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)量上升(P<0.01)，vimentin表達(dá)量下降(P<0.01)。見(jiàn)圖5。

與對(duì)照組比較，**P<0.01

與對(duì)照組比較，**P<0.01

3 討論

宮頸癌是婦科常見(jiàn)的惡性腫瘤，在全球女性惡性腫瘤中發(fā)病率居第二位，僅次于乳腺癌。死亡率已占婦科惡性腫瘤的首位[1]。侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因[2]。MMP是由結(jié)締組織合成分泌的鈣鋅依賴(lài)性蛋白水解酶家族，幾乎能降解除多糖外ECM的所有成分，因此在腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移及血管形成過(guò)程中起著重要作用，是促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)生長(zhǎng)的重要因素。MMP2是屬于明膠酶類(lèi)的MMP，主要降解膠原和纖維連接蛋白，在宮頸癌中過(guò)表達(dá)，并與腫瘤浸潤(rùn)程度及臨床分期有關(guān)[8]。MMP-9是由多種細(xì)胞分泌的一種蛋白水解酶，是MMP中分子量最大的酶，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，從而增加細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，促進(jìn)腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，在宮頸癌組織中也高表達(dá)[9]。上皮來(lái)源的腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的第一步，EMT可誘導(dǎo)原發(fā)部位的腫瘤播散，侵犯周?chē)M織，通過(guò)血液循環(huán)或淋巴循環(huán)轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處形成新的轉(zhuǎn)移灶，在此過(guò)程中腫瘤細(xì)胞的上皮標(biāo)志物E-鈣粘蛋白(E-cadherin)消失，間質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白(vimentin)表達(dá)增加，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力加強(qiáng)。江文靜等[10]證實(shí)E-cadherin的陽(yáng)性率均與宮頸癌的組織分化、臨床分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)。魏潔等[11]也發(fā)現(xiàn)vimentin的表達(dá)與宮頸癌淋巴轉(zhuǎn)移、分化程度密切相關(guān)。因此逆轉(zhuǎn)MMPs及EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，能抑制癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

MACC1是2009年Stein應(yīng)用全基因組表達(dá)分析技術(shù)在結(jié)腸癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新基因，MACC1的表達(dá)是預(yù)測(cè)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移形成和無(wú)轉(zhuǎn)移生存期的獨(dú)立影響因素。MACC1在宮頸癌組織中的表達(dá)較癌旁正常組織中表達(dá)量提高[12]。我們通過(guò)Westernblot也證實(shí)了宮頸癌組織中MACC1的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織。并且MACC1的表達(dá)與多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。如MACC1通過(guò)直接靶向肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體c-Met表達(dá)從而抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲，轉(zhuǎn)移及抗血管生成能力[6]。Pichorner等[13]構(gòu)建結(jié)直腸癌裸鼠移植瘤模型，轉(zhuǎn)染MACC1shRNA后，移植瘤生長(zhǎng)速度減弱，轉(zhuǎn)移能力減弱。因此我們通過(guò)transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)了當(dāng)MACC1被下調(diào)后，可顯著抑制宮頸癌Hela細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。接著我們通過(guò)Westernblot進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)MACC1對(duì)于Hela細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的抑制作用與上調(diào)E-cadherin表達(dá)，下調(diào)MMP2、MMP9及vimentin表達(dá)有關(guān)。Zhang等[14]已證實(shí)MACC1在乳腺癌組織中過(guò)表達(dá)，當(dāng)用siRNA干擾后，可抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移及侵襲，是通過(guò)抑制c-Met及MMP2等蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。Zhen等[5]證實(shí)MACC1沉默后能通過(guò)上調(diào)E-cadherin表達(dá)，下調(diào)MMP9及vimentin表達(dá)，從而抑制大腸癌細(xì)胞HCT116的遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移能力。Gao等[7]也證實(shí)MACC1-shRNA轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞Huh7中，能顯著下調(diào)MMP2、MMP9的表達(dá)，從而降低癌細(xì)胞的遷移侵襲能力。充分說(shuō)明了MACC1對(duì)于宮頸癌Hela細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力的抑制作用，與上調(diào)E-cadherin、下調(diào)MMPs及vimentin表達(dá)有關(guān)。

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The effect of MACC1 on invasion and metastasis of cervical cancer cell

HUANGYing,WULi-ming,ZHANGLing,etal.

(ClinicalLab,YixingPeopleHospitalinJiangsuProvince,Yixing214211,China)

Objective To explore effect of metastasis-associated in colon cancer 1 (MACC1) on invasion and metastasis of cervical cancer cell Hela.Methods Western blot method was used to detect expression of 10 cases of cervical cancer tissues and normal tissues adjacent to carcinoma.siRNA-MACC1 was transfected into cervical cancer Hela cells by liposome.Cell viability was measured by MTT assay.The ability of cell migration and invasion was detected by transwell assay.The expression matrix metalloproteinase (MMPs) and epithelial mesenchymal transition (EMT) related protein was detected by western blot.Results The expression of MACC1 in cervical cancer tissues was higher than that in normal tissues (P<0.01).After siRNA-MACC1 and negative control were transfected into cervical cancer Hela cells by liposome,compared with control group,cell viability,migration and invasion ability was decreased (P<0.01),the expression of MMP2,MMP9 and vimentin was reduced (P<0.01),the expression of E-cadhetin was increased (P<0.01).Conclusion siRNA-MACC1 could inhibit invasion and metastasis of cervical cancer cell Hela,which was associated with reversing the expression of MMPs and EMT related proteins.

MACC1;cervical cancer;invasion;metastasis

國(guó)家自然科學(xué)基金(81001444)

1007-4287(2016)10-1623-04

R737.33

A

黃鶯(1983-)，女，碩士，中級(jí)檢驗(yàn)師，研究方向：生化檢驗(yàn)。

2015-10-24)