石少敏，王 靜，于杜娟，趙永娟

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，吉林 長春130033)

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*通訊作者

Bcl-2抑制劑ABT737增加GSK3抑制劑SB216763引起的A549細(xì)胞凋亡

石少敏，王 靜*，于杜娟，趙永娟

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，吉林 長春130033)

目的 探討SB216763聯(lián)合ABT737對肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的作用及其機(jī)制。方法 MTT法檢測SB216763或聯(lián)合ABT737對A549細(xì)胞增殖的影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測SB216763或聯(lián)合ABT737 對A549 細(xì)胞凋亡的影響。Western blot檢測各組內(nèi)的cleaved caspase3和cytochrome C蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 SB216763抑制了A549細(xì)胞的增殖，且呈現(xiàn)劑量依賴性。ABT737增強(qiáng)了SB216763對A549細(xì)胞的抑制作用。流式細(xì)胞儀結(jié)果表明ABT737增強(qiáng)了SB216762誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Western blot 結(jié)果表明SB216763上調(diào)了cleaved caspase3和cytochrome C蛋白的表達(dá),與SB216763組相比，聯(lián)合用藥處理的細(xì)胞中cleaved caspase-3和cytochrome C的表達(dá)顯著增加。結(jié)論 ABT737增強(qiáng)A549細(xì)胞對SB216763的敏感性，為肺癌的治療提供新靶點(diǎn)。

SB216763；ABT737；肺癌細(xì)胞；凋亡

(ChinJLabDiagn,2016,20:1619)

糖原合酶激酶3(GSK3)是一種可以磷酸化糖原合成酶并使之失活的一種酶，已有研究證明GSK3對于很多癌癥的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要，包括非小細(xì)胞肺癌，抑制GSK3能阻礙細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡[1]。只通過抑制單一靶點(diǎn)雖然在短期內(nèi)效果明顯，但腫瘤會很快對該藥產(chǎn)生耐受性，影響了其治療的效果。多靶點(diǎn)策略治療癌癥已經(jīng)展現(xiàn)了很好的治療效果，標(biāo)志著癌癥的治療進(jìn)入了多靶點(diǎn)時代[2]。Ren T等人研究報道Bcl-2在肺癌中高表達(dá)，并發(fā)揮著促存活的作用[3]。本文探討抑制Bcl-2在GSK3抑制劑SB216763誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞A549中的作用，為臨床治療非小細(xì)胞肺癌提供了很好的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究所用的人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株購自美國 ATCC，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清由Hyclone 公司提供。GSK3抑制劑SB216763和MTT(四甲基偶氮唑藍(lán))均購自美國Sigma公司，ABT737購于AbMole BioScience公司。一抗cleaved caspase-3、cytochrome C及相應(yīng)的二抗購自于自美國Santa Cruz公司。PVDF膜(0.45 μm)購于Millipore 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

培養(yǎng)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞用含10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素各100 U/ml的RPMI 1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于溫度為37℃,CO2濃度為5%、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天換液一次，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時，用0.25%胰酶進(jìn)行消化，按1∶4比例進(jìn)行傳代，待細(xì)胞傳至第三代后進(jìn)行實驗。

1.3 細(xì)胞毒性試驗檢測

MTT法檢測不同濃度SB216763(0,10 20 30 μM)和聯(lián)合用藥組對人非小細(xì)胞肺癌A549增殖率的影響，酶標(biāo)儀檢測每孔光密度(OD)值(570 nm波長)。測三次取平均值，按公式計算細(xì)胞存活率。每次實驗重復(fù)3次。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測

細(xì)胞經(jīng)不同處理后24 h，用不含 EDTA 的胰蛋白酶消化、收集總細(xì)胞，用預(yù)冷 PBS液洗滌2次，每次5 min，棄上清。先加入400 μl結(jié)合緩沖液，重懸細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，再加入6 μl Annexin V-FITC，最后加入 4 μl PI，室溫避光孵育15 min后上機(jī)檢測。

1.5 Western blot檢測

Western blot檢測人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中凋亡蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。①細(xì)胞總蛋白的提?。杭?xì)胞給藥作用24小時后，用胰酶消化收集到離心管中，加入預(yù)冷的PBS(1 ml)，1 000 rpm/min，室溫離心兩次，每次5 min。取上清轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管中，混勻后，4℃，3 000 rpm/min再次離心。倒凈上清，每管加入200 μl-300 μl RIPA 蛋白裂解液(含1%PMSF)，超聲5 s左右打碎基因組后4℃放置45 min(以上全程冰上操作)。之后用4℃、4 000 rpm/min離心，離心15 min，取上清檢測蛋白濃度，按體積比例加入一定量的5× loading Buffer，98℃煮沸10 min使蛋白變性,然后37℃放置10 min冷卻處理后存放在-20℃冰箱保存。②采用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，通過半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉后結(jié)合一抗(cleaved caspase3和cytochrome C工作濃度為1∶1 000)，第二天加入對應(yīng)的二抗(1∶1 000稀釋) 室溫孵育2 h，洗膜3次，一次15 min,兩次5 min,加ECL顯色液 進(jìn)行顯影，提取結(jié)果并用軟件分析數(shù)據(jù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗中的各組數(shù)據(jù)均采用M±SD表示，采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析處理，進(jìn)行one-way ANOVA分析；各實驗組間數(shù)據(jù)的均值比較采用t檢驗。Western blot結(jié)果數(shù)據(jù)的分析，采用天能圖像分析系統(tǒng)以及Quantity One軟件進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果

2.1 SB216763對A549細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)

不同濃度的SB216763(10 μM,20 μM和30 μM)作用于A549細(xì)胞24 h,MTT法結(jié)果顯示不同濃度的SB216763都可以抑制A549細(xì)胞的增殖，且隨著劑量的增加，SB216763的抑制作用也會增強(qiáng)。見圖1。

與control組比較有統(tǒng)計學(xué)意義，*P<0.05。

2.2 SB216763誘導(dǎo)了A549細(xì)胞的凋亡

流式細(xì)胞儀檢測分析結(jié)果顯示不同濃度的SB216763刺激A549細(xì)胞24 h后，細(xì)胞的凋亡率有所增加，且呈現(xiàn)劑量依賴性的方式。見圖2。

與control組比較有統(tǒng)計學(xué)意義，*P <0.05。

2.3 SB216763增加了A549細(xì)胞內(nèi)cleaved caspase-3的表達(dá)

Caspase 3正常以酶原形成存在于胞漿內(nèi)，在凋亡的早期階段，它會被激活并被剪切成cleaved caspase-3。Western blot結(jié)果表明了在對照組內(nèi)cleaved caspase-3的表達(dá)量非常低，不同濃度的SB216763都能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)該蛋白的表達(dá)。見圖3。

2.4 SB216763增加了A549細(xì)胞內(nèi)cytochrome C的表達(dá)

Western blot結(jié)果表明了在對照組內(nèi)cytochrome C的表達(dá)量非常低，不同濃度的SB216763都能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)該蛋白的表達(dá)。見圖4。

與control組比較有統(tǒng)計學(xué)意義，*P<0.05。

與control組比較有統(tǒng)計學(xué)意義，*P<0.05。

2.5 ABT737增強(qiáng)SB216763對A549細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)

實驗分為四組：control組，SB216763組，ABT737組及聯(lián)合用藥組。我們實驗的前期結(jié)果表明了ABT737對A549細(xì)胞的最大無毒劑量是5 μM。因此，在后續(xù)實驗中我們選擇ABT737的劑量為5 μM。根據(jù)圖1的結(jié)果，我們使用SB216763的劑量為20 μM。實驗結(jié)果表明與SB216763組相比，聯(lián)合用藥組抑制了A549細(xì)胞的增殖。見圖5。

與control組比較有統(tǒng)計學(xué)意義，* P<0.05。

2.6 ABT737增強(qiáng)SB216763誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞儀檢測聯(lián)合用藥對A549細(xì)胞凋亡的變化情況，結(jié)果表明SB216763聯(lián)合ABT737組能明顯增強(qiáng)SB216763誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡。見圖6。

與control組比較有統(tǒng)計學(xué)意義，*P<0.05，與SB216763組比較有統(tǒng)計學(xué)意義，#P<0.05。

圖6 SB216763聯(lián)合ABT737 對A549細(xì)胞凋亡的影響

2.7 ABT737增強(qiáng)SB216763誘導(dǎo)的A549細(xì)胞內(nèi)cleaved caspase-3的表達(dá)

Western bolt 檢測四組細(xì)胞內(nèi)cleaved caspase-3的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果表明對照組和ABT737組內(nèi)cleaved caspase-3的表達(dá)量很低，與SB216763組相比，聯(lián)合用藥組能增加cleaved caspase-3的表達(dá)。見圖7。

與control組比較有統(tǒng)計學(xué)意義，*P<0.05，與SB216763組比較有統(tǒng)計學(xué)意義，#P<0.05。

2.8 ABT737增強(qiáng)SB216763誘導(dǎo)的A549細(xì)胞內(nèi)cytochrome C的表達(dá)

Western bolt 檢測四組細(xì)胞內(nèi)cytochrome C的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果表明對照組和ABT737組內(nèi)cleaved caspase-3的表達(dá)量很低，與SB216763組相比，聯(lián)合用藥組能增加cytochrome C的表達(dá)。見圖8。

與control組比較有統(tǒng)計學(xué)意，*P<0.05，與SB216763組比較有統(tǒng)計學(xué)意義，#P<0.05。

3 討論

GSK3是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶(T),GSK3最初是在小鼠骨骼肌中分離純化出來的，它可以磷酸化糖原合成酶(糖原合成最后一步的關(guān)鍵酶)并使之失活。GSK3主要有兩種亞型，即GSK3α和GSK3β，它們廣泛地在組織中表達(dá)。GSK3α編碼51 kDa的多肽，GSK3β編碼47 kDa的多肽。GSK3是一個與眾不同的激酶，它在靜息狀態(tài)的細(xì)胞內(nèi)處于激活的狀態(tài)；而GSK3a的S21位點(diǎn)和GSK3b的S9位點(diǎn)的絲氨酸磷酸化可以誘導(dǎo)GSK3處于失活狀態(tài)[4，5]。最初，關(guān)于絲氨酸/蘇氨酸激酶糖原合成酶3(GSK3)的研究，科學(xué)家們主要集中在調(diào)控糖原合成方面。隨后，研究人員發(fā)現(xiàn)GSK3在許多疾病中發(fā)揮著調(diào)控作用，比如癌癥、衰老、免疫失調(diào)、帕金森癥以及代謝紊亂等等。因此，GSK3可作為一個治療癌癥和其他疾病的潛在的靶點(diǎn)[6]。SB216763是GSK3的一種特異性抑制劑。我們的研究結(jié)果表明了SB216763抑制了肺癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。

Bcl-2是Bcl-2家族蛋白成員之一，在促存活過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Bcl-2蛋白主要定位在線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及核周圍，其在胚胎組織中廣泛地表達(dá)。許多研究已表明Bcl-2基因的高表達(dá)與人腫瘤的惡性程度呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系[7-9]。Bcl-2的高表達(dá)也會導(dǎo)致癌癥患者的預(yù)后不良[8]。ABT737是Bcl-2的抑制劑，它主要通過抑制Bcl-2與其他蛋白的結(jié)合從而抑制了Bcl-2的功能。James Witham等人研究表明ABT737增強(qiáng)了卵巢癌對化療藥物的敏感性[10]。而在我們的實驗中，Bcl-2抑制劑ABT737增加肺癌細(xì)胞對GSK3抑制劑的敏感性。

總之，我們的實驗結(jié)果表明GSK3抑制劑SB216763以劑量依賴性的方式抑制肺癌細(xì)胞A549的增殖并促使其凋亡，與Control組相比，Bcl-2抑制劑ABT737單獨(dú)作用對細(xì)胞增殖和凋亡沒有影響。而ABT737能增加A549細(xì)胞對SB216763的敏感性，這為臨床治療非小細(xì)胞肺癌提供了理論支持。接下來，我們課題組將深入探討ABT737在SB216763誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡中的分子機(jī)制。

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Bcl-2 inhibitor ABT737 enhances A549 cell sensitivity to GSK3 inhibitor SB216763

SHIShao-min,WANGJing,YUDu-juan,etal.

(China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Objective To explore the effect of ABT737 on SB216763 induced A549 cell apoptosis and its underlying mechanism.Methods The effect of SB216763 alone or combined with ABT737 on A549 cells proliferation was employed by MTT assay.Cell apoptosis rate was examined by flow cytometry analysis.Western blot was employed to analyze the protein levels of cleaved caspase-3 and cytochrome C in different groups.Results The proliferation of human lung cell can be inhibited by SB216763 in a dose-dependent manner and ABT737 enhanced the inhibitory effect of SB216763.The flow cytometry data revealed that ABT737 could cause an increase in the apoptosis rate induced by SB216763.Western blot showed SB216763 increased the expression of cleaved caspase-3 and cytochrome C in A549 cell,and when SB216763 and ABT737 were combined,the expression of cleaved caspase-3 and cytochrome C were markedly enhanced.Conclusion ABT737 enhanced the sensitivity of A549 cells to SB216763,providing a new target for lung cancer theragy.

SB216763;ABT737;lung cell;apotosis

1007-4287(2016)10-1619-05

R734.2

A

2015-11-15)