賈 妍，鄒穎剛，許天敏，崔滿華

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科 , 吉林 長春130041)

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重組干擾質(zhì)粒對卵巢癌COC1細胞HDAC1表達的影響

賈 妍，鄒穎剛，許天敏，崔滿華*

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科 , 吉林 長春130041)

目的 構(gòu)建重組HDAC1 基因的短發(fā)夾RNA (shRNA) 慢病毒干擾質(zhì)粒并研究其對卵巢癌COC1細胞HDAC1表達的影響。方法 針對HDAC1 基因設(shè)計特異性siRNA 靶點,構(gòu)建慢病毒干擾質(zhì)粒載體,篩選獲得的有效shRNA 慢病毒干擾序列，將其轉(zhuǎn)染卵巢癌COC1細胞。采用Real-time PCR 方法檢測靶基因在mRNA 水平的沉默效果，Western blot方法檢測靶基因在蛋白質(zhì)水平的沉默效果。結(jié)果 構(gòu)建的慢病毒載體shRNA 的PCR 鑒定和測序正確。 shRNA 慢病毒干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COC1細胞后HDAC1 基因的mRNA 表達量和蛋白質(zhì)水平較陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組均顯著下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論 成功構(gòu)建HDAC1 基因的shRNA慢病毒干擾質(zhì)粒,該慢病毒干擾質(zhì)粒能夠在細胞水平有效沉默靶基因。

HDAC1;短發(fā)夾RNA;慢病毒

(ChinJLabDiagn,2016,20:1615)

卵巢癌在婦科惡性腫瘤中死亡率最高，因為卵巢位于盆腔的深部，病變早期癥狀隱匿，絕大多數(shù)患者在診斷的時候，腫瘤已經(jīng)發(fā)生了廣泛的轉(zhuǎn)移。對于晚期的患者，即使手術(shù)做的很理想，仍然有一部分患者出現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)。術(shù)后一線的化療方案是紫杉醇+卡鉑(TC)的聯(lián)合化療，但療效非常有限，在化療的初期反應(yīng)尚可，很快即出現(xiàn)化療的耐藥，這些都是治療的難點。最近研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白去乙酰化酶抑制劑可以作為上皮性卵巢癌紫杉醇耐藥的一個新的治療靶點[1]。組蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase 1，HDAC1)由Taunton 首先發(fā)現(xiàn)，是第一個哺乳動物的組蛋白去乙酰化酶[2]，HDAC1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。本研究擬構(gòu)建針對HDAC1 的3條慢病毒干擾質(zhì)粒，并篩選最佳的干擾序列，為進一步研究HDAC1與卵巢癌的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人卵巢癌細胞株 COC1為人粘液性卵巢癌細胞株，購自武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物寶藏中心。慢病毒質(zhì)粒 pRNAT-U6.2/Lenti vector來源于GenScript公司，RPMI-1640、小牛血清購自 Invitrogen公司，shRNA序列和引物由ShineGene公司合成,PCR 試劑盒購自Takara 公司，Lipofecter脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自碧云天生物技術(shù)研究所，小量質(zhì)粒抽提試劑盒購自Qiagen公司，感受態(tài)大腸桿菌試劑盒購自Bio sciences公司。PCR擴增儀為Roche公司，Universial 32高速冷凍離心機為Hettich公司，二氧化碳培養(yǎng)箱為日本SANYO公司，超凈工作臺JDJ-203為蘇州凈化設(shè)備廠，倒置顯微鏡為日本OLYMPUS公司。

1.2 構(gòu)建 shRNA 慢病毒表達載體

根據(jù) siRNA 引物的設(shè)計原則，查找NCBI 數(shù)據(jù)庫提供的人HDAC1基因的 mRNA 序列(NM_004964)，設(shè)計針對人HDAC1基因的3條RNA干擾靶序列(3條序列分別命名為sh1：AAAGTCTGTTACTACTACGAC，sh2：AACTGCTAAAGTATCACCAGA，sh3：AATACTTTGGACCAGATTTCA)。經(jīng) BLAST Search 檢索，確認這3條序列與除HDAC1 以外的人類基因無同源序列。根據(jù)干擾序列設(shè)計shRNA的DNA雙鏈模板，包括正義鏈、反義鏈和連接的loop環(huán)，并在5’端融合BamH I位點、3’端融合Xho I酶切位點。應(yīng)用基因重組技術(shù)將這3條RNA干擾靶序列，插入真核表達載體的多克隆位點，使之轉(zhuǎn)染真核細胞后，在U6啟動子的作用下生成小發(fā)卡狀RNA，慢病毒 pRNAT-U6.2/Lenti質(zhì)粒經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切后，與合成的雙鏈DNA 模板進行連接反應(yīng)，連接成功后，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中，12小時后可出現(xiàn)菌落，挑選陽性的重組克隆進行PCR 鑒定，陽性質(zhì)粒分別含有sh1，sh2，sh3這三種序列，標記后送測序公司測序，見圖1。

圖1 pRNAT-U6.2/Lenti載體序列圖

1.3 pRNAT-U6.2-HDAC1 轉(zhuǎn)染卵巢癌COC1細胞

將測序正確的3種質(zhì)粒分別命名為pRNAT-U6.2-HDAC1-sh1，pRNAT-U6.2-HDAC1-sh2，pRNAT-U6.2-HDAC1-sh3，將這3種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染生長狀態(tài)良好的COC1細胞，24 h后熒光顯微鏡下觀察，根據(jù)質(zhì)粒自身攜帶的綠色熒光蛋白計數(shù)轉(zhuǎn)染效率，采用Lipofecter脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒，轉(zhuǎn)染前一天用COC1細胞鋪板，第二天細胞能達到70%-80%，加入轉(zhuǎn)染試劑，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在熒光顯微鏡下，觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染情況。

1.4 Real-time PCR 方法篩選siRNA 有效靶點

將pRNAT-U6.2-HDAC1-sh1，pRNAT-U6.2-HDAC1-sh2，pRNAT-U6.2-HDAC1-sh3三種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染卵巢癌COC1細胞，驗證各個siRNA靶點的基因沉默效率，轉(zhuǎn)染72 h后，收集 總RNA，應(yīng)用Real-time PCR 的方法檢測 HDAC1 mRNA 的表達情況，從而篩選3個靶點的基因沉默效率，上游引物為5′-AACTGGGGACCTACGG -3′; 下游引物為5′-ACTTGGCGTGTCCTT-3′,擴增片段大小為230 bp 。以Actin 為內(nèi)參基因，Actin的上游引物為5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，其下游引物為5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′，擴增片段為229 bp。CT值=2-ΔΔCT。

1.5 Western Blot檢測HDAC-1的蛋白質(zhì)的表達

將pRNAT-U6.2-HDAC1-sh1，pRNAT-U6.2-HDAC1-sh2，pRNAT-U6.2-HDAC1-sh3三種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染卵巢癌COC1細胞，72 h后收集細胞，提取細胞的總蛋白，配制SDS-PAGE凝膠，上樣、轉(zhuǎn)膜、封閉、雜交、曝光，取出顯影、定影。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 針對HDAC1 基因的shRNA干擾質(zhì)粒載體的構(gòu)建

設(shè)計3個HDAC1 基因shRNA的寡核苷酸序列，其5’端和3’端分別融合BamHⅠ、XhoⅠ酶切位點，而且慢病毒載體pRNAT-U6.2/Lenti的多克隆位點也包含這兩個位點，應(yīng)用基因重組技術(shù)，將shRNA序列和載體分別用BamHⅠ 和XhoⅠ雙酶切，兩者具有相同的粘性末端，用T4DNA連接酶進行連接，得到3種針對HDAC1 基因的shRNA干擾質(zhì)粒載體，將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑取陽性單克隆，選取載體上的引物進行PCR擴增反應(yīng)，PCR引物片段大小為250bp，將反應(yīng)產(chǎn)物進行電泳純化，組中在250bp處出現(xiàn)光亮條帶為陽性克隆(見圖2)。選取陽性克隆進行測序鑒定，應(yīng)用Chromas軟件讀取測序結(jié)果，經(jīng)分析、比對，證實3個shRNA序列均已成功插入到慢病毒載體中，形成重組的HDAC1shRNA慢病毒表達載體，從測序結(jié)果的截圖(圖3)中可以看到，3個shRNA序列插入完全正確，表明已經(jīng)成功的構(gòu)建了HDAC1的3個shRNA慢病毒干擾質(zhì)粒，測序鑒定結(jié)果與設(shè)計的3個靶序列相一致。測序結(jié)果表明，HDAC1的3個干擾質(zhì)粒已經(jīng)構(gòu)建成功。

2.2shRNA轉(zhuǎn)染卵巢癌COC1細胞

pRNAT-U6.2慢病毒質(zhì)粒載體為真核表達載體，帶有綠色熒光蛋白標記基因cGFP，轉(zhuǎn)染真核細胞后，在CMV啟動子的作用下轉(zhuǎn)錄生成綠色熒光蛋白，通過熒光顯微鏡，可以觀察到明亮的綠色熒光。實驗結(jié)果顯示：含有HDAC1干擾質(zhì)粒的載體和不含插入片段的空載體均能有效的轉(zhuǎn)染卵巢癌COC1細胞，轉(zhuǎn)染24小時后，用熒光顯微鏡觀察，COC1為懸浮的細胞，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)了細胞的皺縮，使細胞的體積變小，細胞內(nèi)均出現(xiàn)了明亮的綠色，說明質(zhì)粒已經(jīng)成功地轉(zhuǎn)染到COC1細胞內(nèi)(見圖4)。選取3個高倍視野進行觀察，計數(shù)含有綠色熒光的細胞所占比例，即為轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示：HDAC1siRNA干擾質(zhì)粒和不含質(zhì)粒的空載體，轉(zhuǎn)染效率均在70%-80%，表明這種轉(zhuǎn)染方法具有可行性，符合繼續(xù)實驗的標準。

圖2 重組shRNA慢病毒載體PCR鑒定電泳圖 圖3 HDAC1的3個干擾質(zhì)粒測序的結(jié)果

注：A1和A2分別為pRNAT-U6.2/Lenti-HDAC 1質(zhì)粒在熒光視野和明視野的鏡下照片，B1和B2分別為pRNAT-U6.2/Lenti空載體在熒光視野和明視野鏡下照片

圖4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COC1細胞(×100)

2.3 HDAC1 siRNA 有效干擾靶點的篩選

應(yīng)用Real-time PCR方法，檢測上述3 個HDAC1的 shRNA慢病毒干擾質(zhì)粒與陰性對照質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染 COC1細胞后HDAC1在mRNA水平表達的變化,RT-PCR結(jié)果的CT值用2-△△CT來計算，以Actin為內(nèi)參。 1-3 號干擾質(zhì)粒的HDAC1 mRNA的表達量分別為0.857±0.080、0.350±0.091和0.830±0.056(見圖5A),以2 號靶點的沉默效果最好，表達有顯著性差異(P<0.001)，2 號靶點為最有效的 siRNA 靶點,選擇該靶序列HDAC1-sh2質(zhì)粒進行后續(xù)實驗。而陰性對照組和與空白對照組的HDAC1 表達無顯著差異,表明該慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染本身，對HDAC1 基因沒有特異性影響。

2.4 Western blot 進一步驗證3個靶點的有效性

將3種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COC1細胞72小時后收集細胞，進行Western blot實驗，結(jié)果顯示1-3號靶點對 HDAC1的表達量分別為0.89±0.082、0.403±0.049、和0.803±0.060(見圖5A),2 號靶點的沉默效果最好，表達有顯著性差異(P<0.001)，2 號靶點為最有效的 siRNA 靶點，對HDAC1的沉默效果最佳。

A：3種siRNA在卵巢癌COC1細胞中HDAC1 mRNA的表達的柱狀圖B：三組細胞中HDAC1的蛋白印記圖

圖5 三種siRNA的沉默效果

3 討論

組蛋白去乙酰化酶 (HDACs) 的家族非常龐大，真核生物HDACs分為4類[3]，目前發(fā)現(xiàn)的組蛋白去乙?；钢辽儆?8個亞型，每個組蛋白去乙?；冈谡{(diào)控細胞增殖、凋亡中的特異性作用尚不清楚。HDAC1是第一個被發(fā)現(xiàn)的組蛋白去乙?；?，包含482個氨基酸，分子質(zhì)量約為55 KD，位于1p34，其mRNA為2091 bp，是HDACs最具代表性的酶。

肖莉[4]等研究表明HDAC1 在宮頸鱗癌中陽性表達率顯著高于宮頸上皮內(nèi)瘤變和慢性宮頸炎，而且HDAC1 陽性表達率與HPV16/18 感染相關(guān)，與宮頸癌的臨床分期無關(guān)，與組織分化、間質(zhì)浸潤深度

及盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中，HPV16/18 感染可能是通過提高組蛋白去乙?；?的水平抑制轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮作用。高道鍵[5]等研究發(fā)現(xiàn)，HDACl的特異性干擾質(zhì)粒能有效地抑制人胰腺癌PaTu8988 細胞的HDACl 在mRNA和蛋白質(zhì)的表達，同時抑制細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡，其機制可能與上調(diào)p21、Bax 表達，下調(diào)Bcl-2 表達有關(guān)。筆者本人的研究也發(fā)現(xiàn)HDAC1 在卵巢組織中的陽性表達隨組織異型程度的增加而逐漸增高[6]，提示HDAC1 表達增強可能是卵巢癌發(fā)生的早期事件。Ran Zhao[7]等發(fā)現(xiàn)DNA損傷結(jié)合復(fù)合體(DDB)是通過募集HDAC1來抑制Bcl-2在上皮性卵巢癌細胞中的轉(zhuǎn)錄。大量的研究表明，HDAC1在大腸癌、胃癌、前列腺癌和肺癌等均呈高表達，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),抑制HDAC1 有望成為新的腫瘤治療手段。本研究構(gòu)建了針對HDAC1 基因的shRNA 干擾質(zhì)粒，并篩選出沉默HDAC1 效率最高的shRNA 序列，并將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染卵巢癌COC1細胞，并驗證其對HDAC1 的沉默作用，結(jié)果顯示該質(zhì)粒能有效地干擾HDAC1 基因的表達,為進一步鑒定HDAC1 基因在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用提供了條件。

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[7]Ran Zhao,Chunhua Han,Eric Eisenhauer．DNA damage-binding complex recruits HDAC1 to repress Bcl-2 transcription in human ovarian cancer cells[J].Mol Cancer Res,2014,12(3):370.

Interference recombinant plasmids targeting HDAC1 gene in ovarian cancer cell COC1

JIAYan,ZOUYing-gang,XUTian-min,etal.

(DepartmentofObstetricsandGynecology,SecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130041,China)

Objective To construct the shRNA lentiviral plasmid targeting HDAC1 gene and detect its effect of gene silence in COC1 cells.Methods The specific siRNA sequences targeting HDAC1 gene were cloned into pRNAT-U6.2/Lenti lentiviral plasmid.After screening for the valid siRNA ,HDAC1 specific shRNA was transfectted into COC1 cells.Then ,real-time PCR and Western Blot was performed to determine the expression level of HDAC1.Results PCR and sequencing results revealed that shRNA plasmids were correctly constructed.The HDAC1 expressions in COC1 cells were down regulated at mRNA and protein level by plasmid transfection.The expression of HDAC1 was decreased in mRNA levels and protein compared with negative control.Conclusion The recombinant lentiviral shRNA plasmid targeting HDAC1 gene has been successfully constructed.HDAC1 mRNA and protein can be down-regulated availably in COC1 cells.

HDAC1;short hairpin RNA;lentivirus

吉林省科技廳青年科研基金(201201034)

1007-4287(2016)10-1615-04

R737.31

A

2015-10-09)

*通訊作者