鄒淑慧，肖九長，張麗琴，唐金鳳，劉奕紅

（贛州市人民醫(yī)院檢驗科，江西贛州341000）

乙型肝炎病毒特異性CTL表位變異分析

鄒淑慧，肖九長，張麗琴，唐金鳳，劉奕紅

（贛州市人民醫(yī)院檢驗科，江西贛州341000）

目的初步調(diào)查乙型肝炎病毒（HBV）特異性CTL表位的序列特點，同時探討乙型肝炎重癥化和慢性化的可能機理。方法本研究采用PCR擴增法獲取HBV全基因并測序，參考國外文獻報道的17個熱點HBV特異性CTL表位氨基酸序列，分析其與本文獲得的CTL表位氨基酸序列的差別。對患者各個表位變異的差異進行卡方檢驗。結(jié)果獲得46份HBV全基因組序列，急性乙型肝炎（AHB）15例，慢性乙型肝炎（CHB）18例，慢性重型乙型肝炎（CSHB）13例。其中40份屬于B基因型，6份屬于C基因型。對17個表位進行分析發(fā)現(xiàn)，B基因型中變異較大的表位有S183-191，S382-390，C18-27，X36-44，X52-60和X115-123；C基因型中有P816-824，C18-27，X36-44，X52-60和X115-123。P816-824表位在CHB和CSHB組的變異率為27.8%和46.2%，顯著高于AHB組（0%，P＜0.01）；C23-31表位在CHB組的變異率為22.2%，顯著高于AHB和CSHB組（0%，0%，P＜0.05）。結(jié)論了解HBV CTL表位序列特點，分析其與文獻報道的CTL表位的差異情況，對防治乙型肝炎的重癥化和慢性化具有指導(dǎo)意義。

乙型肝炎病毒；CTL表位；變異

乙型肝炎病毒感染以后可表現(xiàn)為急性乙型肝炎（Acute hepatitis B，AHB）、慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）、慢性重型乙型肝炎（Chronic severe hepatitis B，CSHB）、肝硬化（Liver cirrhosis，LC）甚至是肝癌等多種疾病譜［1］。HBV感染主要是由機體免疫反應(yīng)引起的肝細胞病變。HBV特異性細胞毒性T淋巴細胞（Cytotoxic lymphocyte，CTL）識別主要組織相容性復(fù)合體（Major histocompatibility complex，MHC）I類分子以及細胞內(nèi)合成的病毒蛋白肽復(fù)合物，抗原遞呈細胞將其遞呈給免疫淋巴細胞，使HBV感染細胞凋亡［2，3］。研究發(fā)現(xiàn)HBV特異性CTL抗原表位的變異會導(dǎo)致CTL無法識別HBV，病毒難以清除而導(dǎo)致HBV感染慢性化［4，5］。明確HBV特異性CTL主要的識別表位有助于HBV的清除。本研究將對AHB、CHB和CSHB患者中的HBV特異性CTL表位特點進行分析，并探討其對病情發(fā)展和預(yù)后的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料乙肝病毒六項HBsAg，HBsAb，HBeAg，HBeAb，HBcAb，PreS診斷試劑盒（中山生物工程有限公司），DNA提取液（中山大學(xué)達安基因股份有限公司），TransTaq DNA Polymerase High Fidelity（HiFi）試劑盒及DNA Marker由北京Transgen生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 病例來源和DNA分離研究對象：選取2015年1月-2015年6月期間在江西省贛州市人民醫(yī)院就診的慢性乙型肝炎患者。其中AHB組男12例，女3例，平均（46.06±13.37）歲；CHB組男13例，女5例，平均（52.37±12.07）歲；CSHB組男12例，女1例，平均（57.95±10.10）歲。診斷均符合2000年版《病毒性肝炎防治方案》［6］。采集患者靜脈血，分離血清50μl加入50μl DNA提取液，振蕩5s，100℃恒溫10min，12000r·min-1離心5min，上清備用。

1.2.2 PCR擴增目的片段分段PCR擴增及測序引物：AF1：5'-tcc agg atc atc aac aac cag-3'；AR1：5'-gcc tac agc ctc cta gta caa ag-3'；F3：5'-cat gga gac cac cgt gaa cgc-3'；R3：5'-tgt cct tgt gcg ggt tga-3'；F4：5'-cca cac gta gcg cct cat-3'；AR4：5'-ca tcc ata taa ctg aaa gcc-3'，由上海invitrogen生物科技有限公司合成。PCR產(chǎn)物交上海Invitrogen生物科技有限公司測序。反應(yīng)參數(shù)如下：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，共35個循環(huán)；72℃再延伸10min。

1.2.3 目的基因測序?qū)?0μl PCR擴增產(chǎn)物及測序引物2μl/對，委托Invitrogen生物科技有限公司進行DNA測序。

1.2.4 HBV基因分型從GenBank獲得十種基因型HBV S基因序列（A-HE576989、B-AB675676、C-GQ377601、D-AB090268、E-HM363565、F-DQ7 76247、G-GU565217、H-HM117851、I-AF241409、J-AB486012），運用Clustal X和Mega 4軟件對十種基因型以及所測定的HBV S基因序列進行比對，用Kimura2參數(shù)法推算進化距離，Neighborjoining法構(gòu)建進化樹，分型的依據(jù)為標本與十種基因型序列在進化樹中所處的遺傳進化關(guān)系，以此判定HBV的基因型。

1.2.5 序列分析選擇文獻報道中的17個HBV特異性CTL表位，包括HLA-A2限制性表面抗原表位5個、多聚酶抗原表位2個、核心抗原表位3個、X蛋白表位6個以及HLA-A11限制性C蛋白表位1個作為參考序列，用VectorNTI軟件對測定基因序列的推導(dǎo)氨基酸序列與報道的CTL表位段肽序列進行比較。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0軟件對三組患者間各表位變異的差異進行卡方檢驗，P＜0.01為具有非常顯著性差異，P＜0.05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 PCR測序結(jié)果及HBV基因型的判定成功獲得46份完整的基因序列，將獲得的全基因序列與已知的十種基因型S基因序列構(gòu)建進化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)40份標本屬于B基因型，6份屬于C基因型。（圖1）

圖1 HBV S基因遺傳系統(tǒng)進化樹

2.2 CTL表位序列變異差異分析與文獻報道的17個CTL表位序列相比，本文獲取的HBV序列檢出了不同程度的變異，B型和C型HBV基因型對一些表位的變異有明顯影響（表1）。17個CTL表位中有15個表位發(fā)生變異，3個表位沒有變異。X區(qū)變異較大，尤其是X36-44（TLPSPSSSA），X52-60（HLSLRGLFV），X115-123（CLFKDWEEL）表位變異率最高，最高達100%。有的表位B型和C型HBV間變異發(fā)生率有明顯不同，如表位S183-191（FLLTRILTI）變異率在B型和C型中分別為100%（40/40）和16.6%（1/6）；表位S382-390（ILSPFLPLL）變異率則分別為95%（38/40）和33.3%（2/6）；而表位P816-824（SLYADSPSV）變異率分別為15%（6/ 40）和83.3%（5/6）。有些表位變異率很低甚至未發(fā)生變異，如S335-343（WLSLLVPFV）、A2：C117-125（EYLVSFGVW）變異率均為0。有的變異表位發(fā)生多個氨基酸替換，如表位S382-390，C18-27，X36-44，X102-110和X115-123等；有的表位只有一個氨基酸發(fā)生改變，如表位S183-191，P575-583H和C88-96等。同一變異位點的替換氨基酸多為同一種氨基酸，但也有不同的變異種類，如表位X15-23 VLCLRPVGA可變異為VLCLRPVCA或VLCLRPVSA。對AHB、CHB和CSHB三組患者間進行比較時，發(fā)現(xiàn)P816-824表位在CHB和CSHB組的變異率為27.8%和46.2%，顯著高于AHB組（0%，P＜0.01）；C23-31表位在CHB組的變異率為22.2%，顯著高于AHB和CSHB組（0%，0%，P＜0.05）（見表2）。

3 討論

乙型肝炎病毒目前分為A-J 10種基因型，B型和C型為我國主要流行的基因型，基因型對HBV感染的發(fā)病程度有一定影響［7-9］。

HBV特異性CTL應(yīng)答是宿主有效清除肝細胞內(nèi)HBV的關(guān)鍵因素。CTL表位是引起免疫應(yīng)答和免疫反應(yīng)的基本單位，決定CTL特異性殺傷效應(yīng)，在免疫識別和免疫激活中發(fā)揮重要作用。在免疫和抗病毒治療的壓力下，HBV病毒可發(fā)生變異，包括逃逸性表位的變異。病毒的CTL表位變異可能是HBV逃避免疫應(yīng)答，引起乙型肝炎慢性化的重要機制［10-12］。

HBV感染的機制較復(fù)雜，所感染的HBV基因組變異是主要原因之一。本研究采用PCR技術(shù)對乙肝患者血清標本進行DNA擴增并測序，獲得46份完整的基因組序列。急性乙型肝炎（AHB）15例，慢性乙型肝炎（CHB）18例，慢性重型乙型肝炎（CSHB）13例。以國外文獻報道中的17個HBV特異性CTL表位為參考序列，用VectorNTI軟件對測定基因序列的推導(dǎo)氨基酸序列與其進行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，17個CTL表位中有15個表位發(fā)生變異，3個表位沒有變異。其中X區(qū)變異較大，尤其是X36-44（TLPSPSSSA），X52-60（HLSLRGLFV），X115-123（CLFKDWEEL）表位變異率最高，最高達100%。然而這些表位在AHB、CHB及CSHB三組患者間并無統(tǒng)計學(xué)差異。提示國內(nèi)乙肝患者的某些CTL表位與國外報道的可能存在不同，進行疫苗設(shè)計和免疫治療時應(yīng)做相應(yīng)的調(diào)整?；蛐虷BV CTL表位的變異發(fā)生率存在有明顯不同，如S區(qū)表位S183-191（FLLTRILTI）和S382-390（ILSPFLPLL）在B基因型患者中的變異率較C基因型更高。報道稱HBV S區(qū)表位的變異可誘發(fā)CTL特異性免疫反應(yīng)引起疾病慢性化［13］。HBV C區(qū)表位18～27是國內(nèi)外學(xué)者研究中常用的表位，其變異與慢性乙型肝炎及肝纖維化的發(fā)生相關(guān)［14］。然而在本研究中發(fā)現(xiàn)C18-27（FLPSDFFPSV）的變異在三組患者間的變異率都是100%，無統(tǒng)計學(xué)意義。這可能與國內(nèi)外流行的HBV病毒株不同有關(guān)，其特異性CTL表位在大多數(shù)位點上都出現(xiàn)變異，且差異較大，導(dǎo)致研究結(jié)果不盡相同。對AHB、CHB和CSHB三組患者間進行比較，發(fā)現(xiàn)P816-824表位變異率在CHB組（27.8%）和CSHB組（46.2%）中顯著高于AHB組（0%）（P＜0.01），提示該位點的變異與可能會引起肝內(nèi)炎癥活動，加快疾病進程。C23-31表位在CHB組中的變異較高，P＜0.05，提示C23-31變異與慢性乙型肝炎有關(guān)。值得注意的是三組患者中有的表位變異率增高，有的降低，說明各表位在HBV誘導(dǎo)的機體CTL免疫應(yīng)答中所起的作用不同。文獻報道和我們的研究發(fā)現(xiàn)不同患者對各HBV抗原表位的CTL頻率以及反應(yīng)并不一致。

表1 B型和C型HBV特異性CTL表位序列變異位點差異

表2 AHB、CHB和CSHB患者間HBV特異性CTL表位序列變異發(fā)生頻數(shù)比較

HBV感染過程中，宿主免疫反應(yīng)程度與HBV感染后肝纖維化及肝癌發(fā)生有密切關(guān)系［15］。不同患者對HBV抗原表位的CTL頻率和反應(yīng)強度也不盡相同。國內(nèi)乙肝患者的某些CTL表位與國外報道的存在一定差異，因此在進行特異性細胞免疫反應(yīng)研究時，不能簡單套用國外鑒定的表位序列。研究CTL特異性表位的突變情況可為疾病的早期預(yù)防、干預(yù)、疫苗設(shè)計及個性化治療提供科學(xué)依據(jù)。

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Analysis of variation in CTL epitope of Hepatitis B Virus

ZOU Shuhui，XIAO Jiuchang，ZHANG Liqin，TANG Jinfeng，LIUYihong.
Department of Laboratory Medicine，Ganzhou People's Hospital of Jiangxi Province，Ganzhou Jiangxi 341000，China.

Objective To investigate the characteristics of CTL epitope of hepatitis B virus and explore the possible mechanisms of severity and chronicity of hepatitis B.Methods Serum samples were collected from patients infected with hepatitis B virus（HBV），PCR method was used to amplify the whole gene of HBV DNA and the PCR products were sent to be sequenced directly.Amino acid sequences of 17 cytotoxic T Lymphocyte（CTL）epitopes previously reported abroad were taken as

equences，and comparison was made between these reference sequences and CTL epitopic sequences obtained from patients with chronic hepatitis B.The difference was calculated by χ2test.Result Complete HBV genome of 46 samples was successfully amplified and sequenced.15 patients with acute（AHB），18 chronic（CHB）and 13 chronic severe hepatitis B（CSHB）.40 of which belongs to genotype B，while 6 belongs to genotype C.In the 17 analyzed CTL epitopes，S183-19，S382-390，C18-27，X36-44，X52-60 and X115-123 varies greatly in genotype B，while P816-824，C18-27，X36-44，X52-60 and X115-123 in genotype C.The mutation rates at P816-824 were higher in patients with CHB（27.8%）and CSHB（46.2%）than that in AHB（0%，P＜0.01），C23-31 was also higher in patients with CHB（22.2%）than that in AHB and CSHB（0%，0%，P＜0.01）.Conclusion To investigate the characteristics of hepatitis B virus CTL epitopes in infected people and analyze the mutations will aid in treatment and prevention of severity and chronicity of hepatitis B.

Hepatitis B virus；CTL epitopes；Mutation

R446.62，R512.6+2

A

1674-1129（2016）05-0591-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.05.017

2016-04-11；

2016-08-30）

鄒淑慧，女，1988年11月生，碩士學(xué)位，檢驗技師，醫(yī)學(xué)檢驗專業(yè)，研究方向為病原生物學(xué)。E-mail：364235529@qq.com通信作者：張麗琴，女，1981年9月生，學(xué)士學(xué)位，副主任技師，醫(yī)學(xué)檢驗專業(yè)，研究方向為微生物學(xué)及分子生物學(xué)。E-mail：13970781829@163.com