謝為峰，羅豐收，解超男，王 勝，孔令明

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊 830052；2.烏魯木齊西部康維生物科技有限公司，新疆烏魯木齊 830000）

超聲波處理對杏仁粕蛋白質(zhì)理化和功能性質(zhì)的改性研究

謝為峰1，羅豐收1，解超男1，王 勝2，*孔令明1

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊 830052；2.烏魯木齊西部康維生物科技有限公司，新疆烏魯木齊 830000）

以杏仁粕為原料，通過預(yù)處理后得到杏仁粕蛋白，并采用不同的超聲功率對杏仁粕蛋白進行處理，探究超聲功率、蛋白濃度及超聲時間對蛋白質(zhì)的溶解度、巰基及二硫鍵的影響。結(jié)果表明，其最佳條件為超聲功率500 W，蛋白濃度4 g/mL，超聲時間15 min；此時，蛋白質(zhì)的溶解度達到最大為160 mg/g。

杏仁粕；超聲功率；溶解度；巰基；二硫鍵

杏仁是薔薇科杏的種子，分為甜杏仁和苦杏仁，主要含有蛋白質(zhì)、脂肪、糖、微量苦杏仁苷［1］。脂肪的組成中主要是油酸和亞油酸。被工業(yè)榨油后的杏仁粕里所含60%以上的蛋白質(zhì)能夠被提取利用［2］。因此，本研究可以提高杏仁粕的利用率，促進杏仁蛋白產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。超聲處理是利用聲波產(chǎn)生的高頻振蕩，作用于液體對物料產(chǎn)生的一種空化作用，能在瞬間產(chǎn)生較強的機械剪切力，使蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象發(fā)生改變，進一步改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)［3］。

1 材料與方法

杏仁蛋白粉，實驗室制備；NaOH（分析純），杭州恒鑫達化工有限公司產(chǎn)品；HCl（分析純），西安三浦化學試劑有限公司產(chǎn)品。

SK2200LH型雙頻清洗器，上海精密儀器儀表有限公司產(chǎn)品；臺式低溫高速離心機，湖南滬康離心機有限公司產(chǎn)品；FSH-2型可控高速均質(zhì)機，北京中盛利楊科技有限公司產(chǎn)品；PHS-3C型實驗室pH計，上海昂禹環(huán)?？萍加邢薰井a(chǎn)品；EU-2800DS型紫外可見分光光度計，上海昂立儀器有限責任公司產(chǎn)品；SJIA-10N小型臺式真空冷凍干燥機，寧波市雙嘉儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3.1 杏仁粕蛋白提取流程［4］

杏仁粕→粉碎→脫脂→配制溶液→調(diào)節(jié)pH值→離心→取上清液→調(diào)節(jié)pH值→離心→取沉淀物→真空冷凍干燥→杏仁蛋白粉。

1.3.2 杏仁粕蛋白質(zhì)溶解度（NSI）的測定

精確稱取杏仁粕蛋白粉末1.000 g，溶于100 mL蒸餾水中，pH值調(diào)至7.0，然后分別在超聲功率為100，200，300，400，500，600 W下處理15 min，于轉(zhuǎn)速4 500 r/min的條件下離心30 min，取上清液，以考馬斯亮藍法測定上清液的蛋白含量。計算蛋白溶解度的公式如下：

式中：C——測得蛋白質(zhì)量濃度，g/mL；

V——蛋白液體積，mL；

M——杏仁粕蛋白量，g。

1.3.3 杏仁粕蛋白質(zhì)乳化性及乳化穩(wěn)定性測定

取1.000 g杏仁粕蛋白粉，溶于100 mL蒸餾水中，將杏仁粕蛋白溶液pH值調(diào)至7.0，于100，200，300，400，500，600 W超聲功率下處理15 min，取50 mL的杏仁粕蛋白液，添加50 mL的花生油，用可控高速均質(zhì)機均質(zhì)5 min，然后使用離心機以轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心30 min之后，測量杏仁粕蛋白液的乳化層高度，蛋白的乳化性可以用乳化層高度和總液體高度比來衡量。將離心后的溶液于80℃的條件下水浴保溫1 h，放置冷卻后蛋白質(zhì)乳化穩(wěn)定性為再次測定乳化層高度與第1次測得乳化高度的比。

1.3.4 杏仁粕蛋白起泡性和起泡穩(wěn)定性測定

取1.000 g杏仁粕蛋白粉，并將其溶于100 mL的蒸餾水中，將杏仁粕蛋白溶液pH值調(diào)至7.0，于100，200，300，400，500，600 W的超聲功率下處理15 min后，用可控高速均質(zhì)機均質(zhì)5 min，然后快速加到量筒中讀出泡沫的體積。杏仁粕蛋白的起泡性就是其與蛋白液總體積的比。室溫放置30 min后，第2次讀出泡沫的體積，泡沫穩(wěn)定性即為其與第1次讀數(shù)之比。

1.3.5 杏仁粕蛋白中巰基、二硫鍵的測定

（1）巰基的測定。取1.000 g杏仁粕蛋白，放入燒杯中溶解在Tris-Gly緩沖液（pH值8.0）中，并于容量瓶中定容至100 mL，取一定量的杏仁粕蛋白液于100，200，300，400，500，600 W的超聲功率下處理15 min。量取0.5 mL超聲處理過的杏仁粕蛋白液，添加2.5 mL Tris-Gly緩沖液（pH值8.0）的尿素（8 mol/L），再加入0.02 mL的Ellman試劑，將混合液搖勻，并在室溫下放置30 min，然后于波長412 nm處測量其吸光度。計算巰基含量的公式如下：

式中：A0——巰基杏仁粕蛋白液吸光度；

C0——杏仁粕蛋白液質(zhì)量濃度，μmol/g。

（2）二硫鍵的測定。取1.000 g杏仁粕蛋白溶于100 mL，Tris-Gly緩沖溶液（pH值8.0）中，取蛋白液于100，200，300，400，500，600 W的超聲功率下處理15 min。量取0.2 mL超聲處理過的蛋白液，加入10 mol/L脲1 mL與0.02 mL巰基乙醇混合，放置1 h后用12%三氯乙酸沉淀蛋白10 mL。接著取0.5%SDS 3 mL溶解沉淀，然后用同樣的試劑稀釋10倍，加0.05 mL Ellman試劑，采用紫外分光光度計于波長412 nm處測定其吸光度。計算二硫鍵質(zhì)量濃度的公式如下：

式中：A1——二硫鍵樣液吸光度；

C1——巰基質(zhì)量濃度，μmol/g；

C0——樣品質(zhì)量濃度，μmol/g。

2 結(jié)果與分析

超聲功率對杏仁粕蛋白溶解度的影響見圖1。

圖1 超聲功率對杏仁粕蛋白溶解度的影響

蛋白質(zhì)最重要的特性之一就是其溶解度，也是影響蛋白品質(zhì)的一個重要指標。由圖1可知，超聲功率在100～500 W時，杏仁蛋白的溶解度隨著超聲功率的增大而增加，當超聲功率達到600 W時，杏仁蛋白的溶解度基本沒有變化，即溶解度達到了最大值。因此，隨超聲功率的增加蛋白溶解度也隨之增大，這是由于杏仁粕蛋白有18種氨基酸，經(jīng)超聲處理后會使其空化效應(yīng)破壞蛋白分子構(gòu)象，使杏仁粕蛋白分子產(chǎn)生降解，生成多種氨基酸，這些氨基酸對水有一定的親和作用。由于氨基酸的氨基與鄰近的羧基會有靜電作用，蛋白質(zhì)聚沉產(chǎn)生沉淀，然而太強的超聲功率會使空化效應(yīng)起反作用，阻礙蛋白質(zhì)間的聚集，因此能增加蛋白質(zhì)的溶解度。

蛋白質(zhì)量濃度對杏仁粕蛋白溶解度的影響見圖2。

圖2 蛋白質(zhì)量濃度對杏仁粕蛋白溶解度的影響

分別精確稱取一定量的杏仁粕蛋白，并配制1，2，3，4，5 g/mL一系列濃度梯度的杏仁粕蛋白液，在500 W的超聲功率下處理15 min，采用紫外光度計對其進行蛋白測定。由圖2可知，在一定范圍內(nèi)，隨著蛋白質(zhì)量濃度的增加其溶解度增大；蛋白濃度為5 g/mL時，溶解度最大，之后基本不變。超聲波的作用會促使蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使分子內(nèi)部的親水基暴露出來，易與水結(jié)合，使溶解度增加。蛋白質(zhì)量濃度增加至6 g/mL時，超聲作用于蛋白質(zhì)的平均力降低，其親水基不會再增多，蛋白溶解度持平。綜合來看，杏仁粕蛋白質(zhì)量濃度在5 g/mL時，溶解度最大。

超聲時間對杏仁粕蛋白溶解度的影響見圖3。

圖3 超聲時間對杏仁粕蛋白溶解度的影響

稱取定量的杏仁粕蛋白，配制質(zhì)量濃度為5 g/mL的蛋白液，分別在700 W超聲功率下處理5，10，15，20，25 min，然后以轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心，并棄去沉淀，剩下的溶液采用考馬斯亮藍比色法確定蛋白含量。由圖3可知，在一定范圍內(nèi)，超聲處理時間越久蛋白質(zhì)的溶解度越大，在超聲時間15 min時，溶解度最大。這是由于超聲波的作用使蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，使其親水基團暴露在外，可以與水相結(jié)合。但隨超聲時間的持續(xù)進行，蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)較大程度的被破壞，最終導致蛋白質(zhì)變性，溶解度降低。

超聲功率對杏仁粕蛋白起泡性及穩(wěn)定性的影響見圖4。

圖4 超聲功率對杏仁粕蛋白起泡性及穩(wěn)定性的影響

蛋白質(zhì)的起泡性和起泡穩(wěn)定性是影響食品的質(zhì)構(gòu)、口感以及品質(zhì)的重要因素，蛋白質(zhì)可用于表面活化劑被廣泛應(yīng)用在食品的生產(chǎn)加工中。

由圖4可知，在一定范圍內(nèi)，隨著超聲功率的不斷增大，蛋白質(zhì)的起泡性和起泡穩(wěn)定性均與其呈正相關(guān)關(guān)系。超聲功率在400 W時，起泡性達到最大值為50%；超聲功率在300 W時，起泡穩(wěn)定性達到最大值84%。蛋白質(zhì)的起泡性及起泡穩(wěn)定性均是隨超聲功率的增大呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，這可能因為超聲波的空化效應(yīng)促使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)改變，影響了分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而致使杏仁粕蛋白質(zhì)的起泡性及起泡穩(wěn)定性的升高或降低。

超聲功率對杏仁粕蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響見圖5。

圖5 超聲功率對杏仁粕蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

蛋白質(zhì)的乳化性質(zhì)是使油、水形成的穩(wěn)定乳狀液，蛋白質(zhì)的乳化性和乳化穩(wěn)定性可以作為食品工業(yè)加工上的一個重要衡量指標。蛋白質(zhì)中存在親油性基團與親水性基團，可在水油混合的界面相互結(jié)合形成乳狀液體，蛋白質(zhì)具有促進油、水相互乳化的作用，從而形成乳狀液，并能長久保持其穩(wěn)定的能力，這就是蛋白質(zhì)的乳化性。

由圖5可知，隨著超聲功率的增加，蛋白質(zhì)的乳化性也在逐漸增加，當超聲功率達到500 W時蛋白質(zhì)的乳化性達到最大；隨后，超聲功率增加到300 W，蛋白質(zhì)的乳化性卻出現(xiàn)了下降的趨勢，這可能是由于蛋白質(zhì)的溶解性會影響到蛋白質(zhì)的乳化性，但是隨著超聲功率的提高，超聲波會產(chǎn)生強烈空化效應(yīng)導致蛋白質(zhì)分子的化學鍵發(fā)生斷裂，部分蛋白質(zhì)發(fā)生變性，進而致使溶解度與乳化性均下降。同時，蛋白質(zhì)的乳化性及穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)都具有一定的相關(guān)性，超聲功率會在一定程度上破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使疏水基和親水基都呈現(xiàn)在分子表面，而乳化體系的形成就是靠這2類的基團與油、水相互作用產(chǎn)生的乳化現(xiàn)象，故而可以提高蛋白質(zhì)的乳化性。但是，超聲功率太高同樣也會阻止疏水基的暴露，導致乳化能力降低。因此，超聲功率是改性杏仁粕蛋白乳化性能的重要影響因素。

超聲功率對杏仁粕蛋白結(jié)構(gòu)的影響見圖6。

圖6 超聲功率對杏仁粕蛋白結(jié)構(gòu)的影響

二硫鍵是反映蛋白分子立體結(jié)構(gòu)的重要特征，由圖6可知，超聲功率為100～400 W時，巰基含量逐漸降低，并且400 W時最低；但二硫鍵卻是在400 W時最高，隨后當超聲功率進一步增加時，巰基的含量升高、二硫鍵的含量出現(xiàn)了下降。二硫鍵含量下降，表明蛋白質(zhì)中的多肽鏈被降解，進一步會是蛋白質(zhì)變性，喪失生物活性；二硫鍵增加表明蛋白分子的空間構(gòu)象發(fā)生了折疊重排。因此，巰基和二硫鍵含量的變化，都表明超聲處理可改變蛋白質(zhì)分子的立體結(jié)構(gòu)，以達到改變蛋白質(zhì)性質(zhì)的效果。

3 結(jié)論

在試驗中，超聲功率、蛋白質(zhì)量濃度、超聲時間對蛋白質(zhì)的溶解度均有顯著影響。其最佳條件為超聲功率500 W，蛋白質(zhì)量濃度4 g/mL，超聲時間15 min。此時，蛋白質(zhì)的溶解度達到最大為160 mg/g。巰基和二硫鍵含量的變化，都表明超聲處理可改變蛋白質(zhì)分子的立體結(jié)構(gòu)，以達到改變蛋白質(zhì)功能特性的效果。

［1］ 陳貴堂，趙霖.植物蛋白的營養(yǎng)生理功能及開發(fā)利用 ［J］.食品工業(yè)科技，2004（9）：137-140.

［2］ 徐建國，胡青平，王迎籽，等.堿溶酸沉法提取桑椹籽蛋白質(zhì)的工藝優(yōu)化 ［J］.中國糧油學報，2010（6）：98-101.

［3］ 賈俊強，馬海樂，趙偉睿，等.超聲波處理對小麥胚芽球蛋白理化和功能性質(zhì)的影響 ［J］.農(nóng)業(yè)機械學報，2009（8）：105-110.

［4］ 湯茜.堿溶酸沉法制備火麻仁蛋白工藝研究 ［J］.中國釀造，2011（3）：108-110.◇

Almond meal as a raw material，obtained by pretreatment almond meal protein，and using different ultrasonic power for protein processing，explore the ultrasonic power，protein concentration，protein solubility and the thiol groups，the impact of disulfide bonds ultrasonic time.The results show that the optimum conditions are the ultrasonic power 500 W，concentration 4 g/mL，ultrasonic time 15 min.In this case，the maximum solubility of the protein is 160 mg/g.

almond meal；ultrasonic power；solubility；mercapto；disulfide bond

1671-9646（2016）09a-0001-03

TS229

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.09.001

2016-06-30

烏魯木齊高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)創(chuàng)新基金項目（CXJJ2014002）。

謝為峰（1990— ），男，在讀碩士，研究方向為植物蛋白加工。

孔令明（1976— ），男，博士，教授，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。