劉玉洋，傅劍波，林富平，程雪梅，臧德奎

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院,山東　泰安 271018；2.浙江滕頭園林股份有限公司，浙江　寧波 315100)

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大葉樸種子休眠機制的初步研究*

劉玉洋1，傅劍波2，林富平2，程雪梅2，臧德奎1

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院,山東泰安 271018；2.浙江滕頭園林股份有限公司，浙江寧波 315100)

大葉樸種子不經(jīng)處理的情況下發(fā)芽率較低。為探討大葉樸的休眠機制，對大葉樸種子進行了形態(tài)解剖觀察，內(nèi)果皮透水性測定，去殼種子和完整種子的萌發(fā)試驗。同時，還通過對大葉樸的種胚和果皮的甲醇提取液處理白菜籽，研究其內(nèi)源抑制物對白菜籽萌發(fā)率的影響。結(jié)果表明,大葉樸內(nèi)果皮的石細胞化阻礙了種子的吸漲；大葉樸種子培養(yǎng)30、60天后，其帶殼種子的發(fā)芽率為0%，去殼種子的發(fā)芽率為31.1%；白菜籽萌發(fā)試驗結(jié)果表明，大葉樸種子各部分均含有抑制物質(zhì)，抑制強度為內(nèi)果皮大于種胚。

大葉樸；休眠；種殼透水性；萌發(fā)試驗；抑制物質(zhì)

大葉樸(Celtiskoraiensis)屬于榆科(Ulmaceae)樸樹屬(CeltisL.)，落葉喬木，廣泛分布于我國華北、東北、西北區(qū)各省海拔100～1 500m的山坡和溝谷中[1]。大葉樸葉形奇特，有尾狀尖頭，耐干旱、瘠薄，對土壤質(zhì)地要求不嚴，深根性，是典型的遮蔭兼觀葉的樹種，樹皮纖維可代替麻，果可榨油用作肥皂和潤滑劑，是一種極具開發(fā)價值和應(yīng)用前景的野生樹種。而關(guān)于大葉樸的研究，國內(nèi)外尚不多見，僅趙靜利用四種改良的CTAB方法提取了大葉樸的DNA進行比較研究[2]，對大葉樸育苗技術(shù)的研究尚屬空白。目前，大葉樸的人工繁殖和栽培量極少，而且在常規(guī)播種條件下大葉樸的發(fā)芽率極低，加之國內(nèi)外對大葉樸休眠方面的研究尚處空白，影響了大葉樸的開發(fā)利用。因此，探究大葉樸的休眠機制，從理論上闡述其休眠本質(zhì)，可以為大葉樸播種育苗提供參考。

1　材料與方法

1.1供試種子來源

試驗所用材料于2014年10月中旬采自山東泰山。果實采摘后在冷水中浸軟，用手搓洗，去掉其果皮和果肉，采用水選法去掉殘渣，去除空粒種子，挑選飽滿的種子晾干備用。參試種子的平均千粒重為200.45g，含水量7.80 %。

1.2種子的結(jié)構(gòu)形態(tài)觀察

隨機抽取3組上述備用種子,每組100粒，于清水中浸泡2天，使種子充分吸水，以便去除種殼(內(nèi)果皮)。之后，用解剖刀剝離出完整的種胚，對種胚進行橫向和縱向的解剖，觀察種子內(nèi)部形態(tài)結(jié)構(gòu)，并記錄[3]。

1.3種殼透水性測定

選取帶有完整種殼的種子和去掉種殼的種子各30粒，分別稱重，放入燒杯中用清水浸泡，于25℃條件下恒溫吸漲，每隔12h稱重1次，直至恒重。計算兩個處理的吸水率，每個處理重復(fù)3次，取其平均值。

吸水率(%)=〔浸種后重量(W2)-浸種前重量(W1)〕/浸種前重量(W1)× 100%。

1.4種子萌發(fā)試驗

選取室溫下貯藏的種子，先將種子于清水中浸泡72h，使種子充分吸水，按試驗設(shè)計對種殼進行處理。共有兩種處理：A為帶有完整種殼的種子，B為完全去除種殼(保留了種皮)的種子。各處理種子用1‰升汞消毒5min，75%醫(yī)用酒精消毒10min,在無菌條件下接種到MS培養(yǎng)基(MS+8g/L蔗糖+30g/L瓊脂)上，分別于光照(光照16h，黑暗8h,光強2 000～3 000Lx)或黑暗、25℃恒溫條件下進行無菌萌發(fā)試驗[4]。每個處理接種30粒種子，重復(fù)3次。每隔5天觀察種子的發(fā)芽率及生長狀況，30天時統(tǒng)計發(fā)芽率。種胚的萌發(fā)以幼根長度大于胚長為準。種子的發(fā)芽率=種子發(fā)芽數(shù)量/種子總量×100%[5]。

1.5抑制物質(zhì)的生物測定

參考王小平等[6]的方法，略有改動。將大葉樸種子分為種殼(內(nèi)果皮)和種胚兩部分，分別取2g，液氮冷凍后，用 80%甲醇10mL研磨，置于4℃下充分浸提48h，重復(fù)浸提3次，混合浸提液，過濾掉殘渣，減壓濃縮后用蒸餾水定容至20mL，濃度為0.1g/mL。將原溶液分別稀釋為0.02g/mL、0.04g/mL、0.06g/mL、0.08g/mL和0.1g/mL。分別取上述溶液5mL，加入直徑為9cm的培養(yǎng)皿中(培養(yǎng)皿中預(yù)先鋪設(shè)兩層濾紙)，每個培養(yǎng)皿中放50粒白菜種子(白菜種子預(yù)先在溶液中浸泡2h)進行發(fā)芽試驗，以蒸餾水為對照，于光照(光強2 000～3 000 Lx)、25℃條件下培養(yǎng)，48h測定白菜籽的發(fā)芽率，72h測定其種子胚根長。每個處理重復(fù)3次，并進行差異性顯著試驗分析。

2　結(jié)果與分析

2.1大葉樸種子的外部形態(tài)特征

大葉樸果實為核果，種子(果核)呈寬倒卵形，種子的縱軸長為6.5～7.8mm，橫軸長為5.5～6.0mm，厚度為5.4～6.8mm，先端圓鈍，基部漸窄，截形，兩側(cè)有縱棱，表面灰白色。內(nèi)果皮由一系列排列緊密的石細胞組成，骨質(zhì)，厚度在0.5～0.7mm，內(nèi)種皮厚可能是導(dǎo)致大葉樸休眠的原因之一。種皮膜質(zhì)較薄，淡褐色，常緊貼種胚。

在解剖的100粒種子中，100%種胚發(fā)育完全，無胚乳，胚呈乳白色，兩片子葉肥厚充滿胚腔，多層折疊，油質(zhì)，具有胚芽、胚軸和裸露的胚根。

2.2不同處理對種子透水性的影響

種皮、果皮等的機械障礙作用會影響種子的吸水、透氣性，最終影響到種子的萌發(fā)[7]。圖1表明，浸泡12h，帶殼種子與去殼種子的吸水率均明顯增加，去殼種子浸泡12h的吸水率達到11.6%，而帶殼種子的吸水率只有2.4%，二者具有極顯著差異。

圖1　不同種殼處理對大葉樸種子吸水率的影響 注：圖中相同字母表示差異不顯著，不同大寫字母表示 差異極顯著(p<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著 (p<0.05)。Fig.1　Effects of different husk treatments on water absorption rate of Celtis koraiensis seeds

浸泡36h，帶殼種子的吸水率仍在增加，且達到顯著水平，而去殼種子的吸水率出現(xiàn)了下降現(xiàn)象。這可能是由于大葉樸種子沒有了種殼(內(nèi)果皮)的保護，加之細胞外的水勢高于細胞內(nèi)，使得種子無限吸漲，質(zhì)膜滲透壓增加，最終導(dǎo)致種子破裂的結(jié)果[8]。

兩處理的種子吸水都達到飽和后，帶殼種子的吸水率比去殼種子的吸水率小7.39%，方差分析表明兩處理的差異達到極顯著水平(F=12 913.043，P=0.00<0.01)。帶殼的大葉樸種子雖然能透水，但與去殼種子相比，帶殼種子的內(nèi)果皮對大葉樸的吸水存在一定的障礙。

2.3不同處理對種子萌發(fā)的影響

根據(jù)試驗觀察，完全去除內(nèi)果皮的種子在空白培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天時，就開始有種子萌動(表1，圖2a)。

表1　不同外殼處理對種胚和種子萌發(fā)的影響Tab.1　Effects of different husk treatments on germination of embryos and seeds

由表1可知，去除種殼(內(nèi)果皮)的種子培養(yǎng)60天的發(fā)芽率為31.1%，而完整種子的發(fā)芽率為0。綜上所述，大葉樸內(nèi)果皮有一定的機械束縛和透性障礙，這是導(dǎo)致大葉樸種子不能萌發(fā)的原因之一。

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圖2不同種殼處理對種子萌發(fā)的影響

a為去除種殼的種子培養(yǎng)5天；b為去除種殼的種子培養(yǎng)15天；c為去除種殼的種子培養(yǎng)30天；d為完整種子培養(yǎng)30天

Fig.2Effects of different husk treatments on seed germination

2.4內(nèi)果皮和胚的甲醇提取液對種子萌發(fā)的影響

大葉樸種子種胚及內(nèi)果皮甲醇浸提液對白菜籽萌發(fā)具有抑制作用(圖3)。隨著抑制物質(zhì)濃度的增加，白菜籽的發(fā)芽率逐漸降低，種子胚根的長度縮短(表2)，內(nèi)果皮與種胚的甲醇提取液對白菜籽的萌發(fā)均有一定的抑制作用，其中以內(nèi)果皮的抑制作用最強，濃度為0.03g/mL的內(nèi)果皮甲醇浸提液對白菜籽的萌發(fā)達到了完全抑制的效果，而種胚的抑制活性較弱，0.04g/mL時種胚浸提液對白菜籽萌發(fā)才到達完全抑制的效果(表2)。據(jù)此可以初步推斷大葉樸種子內(nèi)果皮與胚中均含有抑制種子萌發(fā)的物質(zhì)，抑制強度為內(nèi)果皮>種胚。

白菜籽胚根長的方差分析結(jié)果表明內(nèi)果皮和種胚浸提液濃度為0.04g/mL和0.05g/mL時對白菜籽胚根長的影響均達到了極顯著水平(P<0.01)。

圖3　大葉樸種子各部分不同濃度甲醇浸提液對 白菜種子發(fā)芽率的影響Fig.3　Effects of extracted methanol with different concentrations on germination rate of cabbage表2　大葉樸種子各部位甲醇浸提液對 白菜籽萌發(fā)的抑制作用Tab.2　Inhibitory effects of extracted methanol from different parts of Celtis koraiensis seeds on the cabbage germination

項目濃度/g·mL-1白菜種子萌發(fā)率/%胚根長/mm對照-99.33±0.01Aa2.83±0.50Aa種胚 0.0185.00±0.05Bab2.86±0.47Aa0.0273.00±0.12Cbc2.95±0.84Aa0.0339.00±0.06Cc2.77±0.48Aa0.040.67±0.01Dd1.39±0.24Ba0.050.00±0.00Bd0±0.00Bb內(nèi)果皮0.0149.33±0.08Cb3.35±0.5Aa0.028.67±0.08Cc3.30±0.46Aa0.030.67±0.01Cc2.82±0.68Aa0.040.67±0.01Cc0±0.00Bb0.050±0.00Cc0±0.00Bb

注：表中相同字母表示差異不顯著，不同小寫字母表示差異顯著p< 0.05，不同大寫字母表示差異極顯著p< 0.01。

3　討論

種子的休眠是植物為抵御不良環(huán)境，維持自身發(fā)展而形成的一種生物學(xué)特性[9]。種子形成自然休眠的原因較為復(fù)雜，研究表明，種皮(包括果皮)堅硬致密，或有油脂、蠟質(zhì)等原因使種子不透水不透氣，從而阻礙種子萌發(fā)[10]。周曉峰對幾種冬青屬(IlexL.)植物研究也表明種皮透氣性差是種子休眠的主要原因，種皮的機械障礙，種皮的透水性在一定程度上阻礙了種子的萌發(fā)[11]。李近雨在對核桃(Juglansregia)的研究中發(fā)現(xiàn)，核桃種殼的機械障礙是種子萌發(fā)慢的主要原因[12]。程廣有等在對東北紅豆杉(Taxuscuspidata)的研究中指出東北紅豆杉種皮堅硬，表面角質(zhì)化，透水透氣性差，影響種子吸漲和萌發(fā)[13]。本研究中通過對大葉樸種子吸水率的研究發(fā)現(xiàn)：去掉內(nèi)果皮的種子吸水率、萌發(fā)率遠大于完整種子，內(nèi)果皮堅硬阻礙了種子與外界環(huán)境的水汽交換，這在一定程度上阻礙了大葉樸種子的萌發(fā)，這可能是導(dǎo)致大葉樸種子休眠的原因之一。

Albertus Magus(1206—1280年)最早提出植物種子推遲發(fā)芽與其所含抑制物質(zhì)有關(guān)[14]，諸多研究也顯示種子中含有的萌發(fā)抑制劑是種子休眠的重要原因。劉成功等在對南方紅豆杉(Taxuschinensisvar.mairei)的研究中發(fā)現(xiàn)新鮮的種子中含有萌發(fā)抑制物質(zhì)，甲醇浸提液的提取物對白菜籽的發(fā)芽率有極其顯著的抑制作用[15]。李淑嫻等在對烏桕(Sapiumsebiferum)種子休眠的研究中發(fā)現(xiàn)烏桕種子的種皮和胚乳浸提液對白菜種子發(fā)芽有顯著抑制作用，種子的種皮及胚乳存在的內(nèi)源抑制物質(zhì)，可能是造成烏桕種子休眠的主要原因[16]。張少強在對芍藥(Paeonialactiflora)種子的研究中也發(fā)現(xiàn)了抑制物質(zhì)，且濃度越大，抑制作用越強[17]。韓月喬等對白蘚(DictamnusalbusL.)種子的研究發(fā)現(xiàn)，白蘚種皮存在萌發(fā)抑制物質(zhì)[18]。羅登攀等對臘梅(Chimonanthuspraecox)的研究顯示臘梅的萌發(fā)抑制物質(zhì)主要存在于種仁中[19]。本研究結(jié)果顯示大葉樸的內(nèi)果皮和種胚均含有萌發(fā)抑制物質(zhì)，且隨著濃度的增加抑制作用更加顯著，這些成分可能是導(dǎo)致種子休眠的原因，有關(guān)抑制物質(zhì)成分的測定有待進一步研究。

大葉樸種子萌發(fā)試驗表明室溫下貯藏的種子，完全去除內(nèi)果皮的種子萌發(fā)率提高，而具有完整內(nèi)果皮的種子萌發(fā)受到抑制，且種子解剖過程中發(fā)現(xiàn)大葉樸種胚發(fā)育完全，不存在形態(tài)后熟，通過大葉樸種子萌發(fā)試驗確定了內(nèi)果皮對種子萌發(fā)的抑制作用，內(nèi)源抑制物質(zhì)的提取試驗表明內(nèi)果皮與種胚均具有抑制種子萌發(fā)的物質(zhì)。因此，內(nèi)果皮的機械抑制，種胚及果皮中內(nèi)源抑制物的存在是大葉樸種子休眠的主要原因，這為生產(chǎn)上采用何種催芽技術(shù)提供了理論依據(jù)。

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Preliminary Study on Seed Dormancy Mechanism of Celtis koraiensis

LIU Yu-yang1,FU Jian-bo2,LIN Fu-ping2,CHENG Xue-mei2,ZANG De-kui1

(1.Forestry College,Shandong Agricultural University，Taian Shandong 271018，P.R.China；2.Tengtou Garden corporation，Ningbo Zhejiang 315100，P.R.China)

The germination rate ofCeltiskoraiensisseed is very low without any treatment.In order to discuss the dormancy characteristics ofCeltiskoraiensisseeds,anatomical structure observation,water permeability of endocarp, seed germination test were conducted in this research,and the influence of its endogenous inhibitors was also studied through different treatments of cabbage seeds with methanol extracted from embryo and peel ofCeltiskoraiensisseed.The result showed that sclereid of inner pericarp cell resulted in imbibition ofCeltiskoraiensisseed,germination rate ofCeltiskoraiensisseed with coat after 30 or 60 days’ cultivation were zero,and that of seed without coat raised to 31.1%.Germination test of cabbage seeds indicated that the inhibitors were distributed in all parts ofCeltiskoraiensisseed,and the inhibition of inner pericarp was stronger than that of embryo.

Celtiskoraiensis；seed dormancy；permeability of husk；germination test；inhibitors

10.16473/j.cnki.xblykx1972.2016.05.013

2015-10-25

山東省農(nóng)業(yè)良種工程重大課題“林木種質(zhì)資源收集保護與評價”(魯農(nóng)良字[2010]6號)。

劉玉洋(1991-)，女，碩士生，主要從事園林植物種質(zhì)資源及遺傳育種研究。E-mail:liuyuyang20140485@163.com

簡介：臧德奎(1966-)，男，教授，博士，主要從事植物分類和種質(zhì)資源研究。E-mail:zangdk@sdau.edu.cn

S 792.99

A

1672-8246(2016)05-0068-05