許珊麗，蒲秀瑛，楊曉華，郭愛軍，岳 蘭

1蘭州市第一人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2蘭州理工大學生命科學與工程學院；3 蘭州理工大學醫(yī)院

貫葉連翹提取物對流感病毒感染小鼠免疫功能的影響

許珊麗1，蒲秀瑛2△，楊曉華3，郭愛軍3，岳 蘭3

1蘭州市第一人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2蘭州理工大學生命科學與工程學院；3 蘭州理工大學醫(yī)院

目的：觀察貫葉連翹提取物對流感病毒感染小鼠免疫功能的影響。方法：將昆明種小鼠40只隨機分為模型對照組、正常對照組、達菲組（10 m g/kg）及貫葉連翹提取物高、低劑量組，每組8只。除正常對照組外，其余各組以流感病毒鼠肺適應株滴鼻感染小鼠后，分別灌服不同的藥物（貫葉連翹提取物高劑量組100 m g/kg、低劑量組50 m g/kg和達菲組3 m g/kg）0.2 m L/次，2次/d，5天后摘眼球放血處死小鼠，摘取胸腺和脾臟并計算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)；采用M TT法測定小鼠治療前后T、B淋巴細胞轉(zhuǎn)化率、巨噬細胞的吞噬功能及N K細胞的殺傷活性。結(jié)果：貫葉連翹提取物作用于流感病毒感染小鼠后，胸腺和脾臟指數(shù)均有所上升，與模型對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；高、低貫葉連翹提取物組T、B淋巴細胞轉(zhuǎn)化率、巨噬細胞的吞噬功能及N K細胞的殺傷活性與模型對照組相比上升明顯（P＜0.01）。結(jié)論：貫葉連翹提取物對流感病毒感染小鼠機體有一定免疫調(diào)節(jié)作用。

流感病毒；免疫臟器指數(shù)；吞噬功能；淋巴細胞轉(zhuǎn)化率；N K細胞活性；貫葉連翹提取物

流行性感冒(簡稱流感)是由流感病毒(In-fluenza virus，IFV)引起的一種發(fā)病率高、流行廣泛、傳播迅速的急性病毒性呼吸道傳染病，是人類至今尚未能有效控制的世界性傳染病之一。流感病毒侵襲機體，除了流感病毒直接作用于機體造成的損害以外，機體的免疫應答所造成的炎性損傷也起了至關重要的作用。從中藥研究成果分析，中藥在防治流感方面有著廣闊的前景［1］。中藥治療流感，關鍵不在于對流感病毒的直接殺傷作用，而在于對機體免疫功能的調(diào)節(jié)。

貫葉連翹(Hypericum perforatum L.)屬于藤黃科(Guttife-rae)金絲桃屬多年生草本植物。近年來研究發(fā)現(xiàn)，該屬植物具有抗病毒［2-3］、抗菌抗炎［4］和增強免疫功能［5］等藥理活性。本課題組前期曾對貫葉連翹提取物的抗流感病毒作用進行研究，取得了良好效果［6］。為探討貫葉連翹提取物是否通過調(diào)節(jié)機體免疫機能達到緩解流感的作用，揭示其抗流感機理，特進行本研究，通過貫葉連翹提取物對流感病毒感染小鼠的免疫功能的調(diào)節(jié)，探討貫葉連翹提取物治療流感的免疫作用機理，以期為貫葉連翹提取物的臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物 貫葉連翹采自甘肅隴南，經(jīng)甘肅省藥品檢驗所鑒定為藤黃科金絲桃屬多年生草本植物的干燥葉。貫葉連翹提取物由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所農(nóng)業(yè)部新獸藥工程重點開放實驗室制備，含金絲桃素4.73%(高效液相色譜法測定)。用少量聚山梨酯溶解后以蒸餾水稀釋成實驗所用藥物濃度。達菲(奧司他韋爾)由中國農(nóng)業(yè)大學提供，純度達95%。

1.2 病毒株 甲1型流感病毒鼠肺適應株(A/PR/8/1934)(IAV)由中國疾病預防控制中心提供，經(jīng)10日齡雞胚尿囊腔接種培養(yǎng)傳代，微量血凝實驗滴定病毒效價，血凝效價測定1∶512的病毒株為實驗用毒株，液氮保存。正式實驗前測定小鼠病毒半數(shù)致死量(LD50)為10-4.47。

1.3 實驗動物 昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，由蘭州大學動物實驗中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(甘)2013-0003；實驗動物使用許可證號SYXK(甘)2013-0003。

1.4 試劑與儀器 脂多糖(LPS)，刀豆蛋白A (ConA)，1640培養(yǎng)基，二甲基亞砜(DMSO)和噻唑蘭(MTT)均由Sigma公司提供；YAC-1細胞(上海天呈科技有限公司)；L-谷氨酰胺(Hualvyuan biotechnology)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；胰蛋白酶(Lvshengyuan biotechnology)；阿氏液和5%雞紅細胞懸液由本實驗室自制；ZDX-35BI型座式自動電熱壓力蒸汽滅菌器(上海申安)、Thermo Biofuge Stratos低溫離心機(上海賽默科技生物發(fā)展有限公司)、Thermo Multiskan MK3酶標儀(上海賽默科技生物發(fā)展有限公司)，F(xiàn)SH-2型可調(diào)高速勻漿器(武漢格萊莫監(jiān)測設備有限公司)，JA2003N精密電子天平(上海精科天美儀器有限公司)等。

1.5 胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的測定［7］將40只體質(zhì)量18～22 g的昆明種小鼠隨機分為模型對照組、正常對照組、達菲組(10 m g/kg)及貫葉連翹提取物高劑量組(100m g/kg)和低劑量組(50m g/kg)，雌雄各半，每組8只。除正常對照組外，各組在乙醚輕度麻醉下感染1/3 LD50甲1型流感病毒鼠肺適應株50 μL，于感染后4小時開始灌胃給藥，0.2 m L/次，連續(xù)5天；正常對照組予同容積無菌蒸餾水灌胃。治療5天后稱體質(zhì)量、摘眼球放血處死小鼠，剖胸腔摘取胸腺，打開腹腔摘取脾臟，以生理鹽水洗滌2次，用濾紙吸干表面水份，用電子天平稱其質(zhì)量，按下列公式計算逐個計算：

胸腺指數(shù)=(小鼠胸腺重/小鼠體質(zhì)量)×100

脾臟指數(shù)=(小鼠脾重/小鼠體質(zhì)量)×100

1.6 T、B淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的測定［8］將感染及治療5天后的小鼠摘眼球放血處死后，無菌摘取脾臟，研磨，過200目細胞篩，1 500 r/m i n離心10分鐘，加入Tri s-N H4Cl溶液破壞紅細胞，用PBS洗細胞2次，用完全RPM I-1640培養(yǎng)液重懸細胞，制得脾細胞懸液。顯微鏡下計數(shù)，用完全RPM I1640培養(yǎng)液調(diào)細胞濃度為2×106/m L，細胞懸液內(nèi)一份加入ConA，使ConA終濃度為5 μg/m L，待測T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率；另一份加入LPS，使LPS終濃度為10 μg/m L，待測B淋巴細胞轉(zhuǎn)化率。在96孔培養(yǎng)板中加200 μL/孔，4個重復孔，置37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育48小時，每孔輕輕吸出上清液100μL，加入5m g/m L的M TT10μL/孔，置37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育4小時，后加入10%SDS-H Cl 100 μL/孔，振蕩，37℃過夜，酶標儀570 nm下測定各孔A值。以各樣本A值代表其淋巴細胞的增殖能力。

1.7 小鼠脾臟的N K細胞殺傷活性的測定［9］將感染及治療5天后的小鼠摘眼球放血處死后，無菌摘取脾臟，常規(guī)制備脾細胞懸液，培養(yǎng)4小時，去除貼壁細胞。調(diào)細胞濃度為2×106/m L，加入96孔細胞培養(yǎng)板中，每只小鼠4孔(2孔為測試孔，2孔為效應細胞對照孔)，50μL/孔。在測試孔內(nèi)加入濃度為1×105/m LYAC-1細胞懸液50 μL/孔，使效靶比為20∶1；在對照孔中加入完全RPM I 1640培養(yǎng)液50μL/孔。同時另設3孔為靶細胞對照孔(濃度為1×105/m L靶細胞懸液50 μL/孔，再加入完全RPM I1640培養(yǎng)液50μL/孔)?；靹?，置37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育24小時，加5 m g/m L的M TT 10 μL/孔，置37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育4小時，加入10%SDS-H Cl 100μL/孔，振蕩，37℃過夜，酶標儀570nm下測定各孔A值。按下列公式換算成N K細胞活性的百分率：

N K細胞活性(%)=［1-(測試孔A值-對照孔A值)/靶細胞A值］×100%

1.8 小鼠巨噬細胞吞噬功能的測定［10］于感染后第5天，最后1次給藥后24小時經(jīng)腹腔注射5%雞紅細胞懸液0.5m L，間隔4小時后，腹腔再注射生理鹽水2 m L，頸椎脫臼處死動物，輕揉腹部，然后剖開腹腔，輕輕吸出腹腔洗液，分滴于兩張載玻片上，放入濕盒內(nèi)，37℃孵箱孵育30分鐘，孵畢，以生理鹽水輕輕沖洗，洗去未貼壁的細胞，晾干，以丙酮∶甲醇(1∶1)溶液固定10分鐘，再以10%(V/V)Gi em sa-磷酸緩沖液染色15分鐘，蒸餾水沖洗自然晾干，鏡檢。選擇染色清晰的視野，高倍鏡下計數(shù)100個巨噬細胞，同時計數(shù)吞噬紅細胞的巨噬細胞數(shù)，和吞噬的紅細胞總數(shù)。然后按下列公式計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。

吞噬率=吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)/計數(shù)的巨噬細胞數(shù)×100%

吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細胞總數(shù)/計數(shù)的巨噬細胞數(shù)×100%

1.9 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以(±s)表示，采用單因素方差分析，組間多重比較采用Dunnett-t檢驗，檢驗水準為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 貫葉連翹提取物對流感病毒感染小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響 流感病毒感染小鼠后，胸腺指數(shù)降低，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，采用貫葉連翹提取物和達菲治療后胸腺指數(shù)有所回升，且高劑量貫葉連翹提取物組與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，低劑量組與達菲組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。流感病毒感染小鼠后，脾臟指數(shù)降低，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，采用貫葉連翹提取物和達菲治療后脾臟指數(shù)明顯上升(P＜0.05)；尤其以高劑量貫葉連翹提取物組上升更為顯著，且與達菲組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 貫葉連翹提取物對流感病毒感染小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響(±s)

表1 貫葉連翹提取物對流感病毒感染小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響(±s)

注：與模型對照組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與達菲組比較，▲表示P＜0.05。

組別 只數(shù) 劑量/（m g·kg-1） 胸腺指數(shù) 脾臟指數(shù)正常對照組 8 - 0.22±0.08** 0.46±0.014**模型對照組 8 - 0.09±0.02 0.32±0.027貫葉連翹提取物高劑量組 8 100 0.15±0.12* 0.43±0.011**▲貫葉連翹提取物低劑量組 8 50 0.12±0.07 0.41±0.025**達菲組 8 3 0.13±0.06 0.37±0.018*

2.2 貫葉連翹提取物對流感病毒感染小鼠T、B淋巴細胞增殖的影響 各組小鼠的脾細胞，加ConA后，模型對照組吸光度A值降低，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，加入貫葉連翹提取物和達菲后，A值顯著上升(P＜0.01)。且高、低劑量貫葉連翹提取物組與達菲組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。各組小鼠的脾細胞，加LPS后，模型對照組A值降低，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，加入貫葉連翹提取物和達菲后脾臟指數(shù)回升(P＜0.01)。且高、低劑量貫葉連翹提取物組與達菲組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表2。

表 2 貫葉連翹提取物對流感病毒感染小鼠T、B淋巴細胞增殖的影響(±s)

表 2 貫葉連翹提取物對流感病毒感染小鼠T、B淋巴細胞增殖的影響(±s)

注：與模型對照組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與達菲組比較，▲表示P＜0.05；▲▲表示P＜0.01。

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2.3 貫葉連翹提取物對流感病毒感染小鼠N K細胞活性的影響 流感病毒感染小鼠后，N K細胞活性降低(P＜0.01)，加入貫葉連翹提取物和達菲后N K細胞活性上升(P＜0.05)；尤其以高劑量貫葉連翹提取物組上升更為明顯，且與達菲組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表3。

表3 貫葉連翹提取物對流感病毒感染小鼠N K細胞活性的影響(±s)

表3 貫葉連翹提取物對流感病毒感染小鼠N K細胞活性的影響(±s)

注：與模型對照組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與達菲組比較，▲表示P＜0.05。

組別 只數(shù) 劑量/（m g·kg-1） N K細胞活性/%正常對照組 8 - 71.23±2.54**模型對照組 8 - 46.51±3.66貫葉連翹提取物高劑量組 8 100 63.27±1.25**▲貫葉連翹提取物低劑量組 8 50 60.18±3.41**達菲組 8 3 57.12±1.59*

2.4 貫葉連翹提取物對流感病毒感染小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響 模型對照組巨噬細胞的吞噬率和吞噬指數(shù)降低，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，貫葉連翹提取物和達菲組巨噬細胞的吞噬率和吞噬指數(shù)有所上升。尤其是高、低劑量貫葉連翹提取物組上升顯著，與達菲組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表4。

表4 貫葉連翹提取物對流感病毒感染小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響(±s)

表4 貫葉連翹提取物對流感病毒感染小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響(±s)

注：與模型對照組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與達菲組比較，▲表示P＜0.05，▲▲表示P＜0.01。

組別 只數(shù) 劑量/（m g·kg-1） 吞噬率/% 吞噬指數(shù)正常對照組 8 - 73.880±4.201** 7.541±0.413**模型對照組 8 - 51.410±3.422 5.092±0.441貫葉連翹提取物高劑量組 8 100 74.700±5.606**▲▲ 7.524±0.154**▲▲貫葉連翹提取物低劑量組 8 50 70.010±4.244**▲ 7.109±0.012**▲達菲組 8 3 63.920±3.543* 6.065±0.173*

3 討論

貫葉連翹在民間已有2400年的藥用歷史，傳統(tǒng)中醫(yī)藥學認為，該屬植物具有清熱解毒、消腫止血、利濕止痛等功效。機體免疫功能包括非特異性免疫與特異性免疫兩大方面。非特異性免疫是指對所有病原微生物都有一定程度的抵抗能力，又稱為天然免疫或先天性免疫。特異性免疫是指機體針對某一種或某一類微生物或其產(chǎn)物所產(chǎn)生的特異性抵抗力，包括體液免疫和細胞免疫。胸腺和脾臟是動物體內(nèi)主要的免疫器官。免疫器官的重量是反應機體非特異性免疫功能重要而直觀的指標，胸腺和脾臟指數(shù)能反映免疫器官的發(fā)育和免疫細胞的功能狀況。

在非特異性免疫的基礎上，機體能產(chǎn)生針對病毒等病原體的特異性免疫應答，根據(jù)在免疫應答中起主要作用的免疫活性細胞的不同，可將其分為細胞免疫(T細胞介導的免疫應答)和體液免疫(B細胞介導的免疫應答或抗體應答)兩大類。免疫系統(tǒng)中的T細胞分支進化到主要對感染細胞的監(jiān)視，而B細胞產(chǎn)生的抗體主要抵御游離病毒［11］。所以，B淋巴細胞的增殖可以反映體液免疫的水平，T淋巴細胞的增殖可以反映細胞免疫的水平。淋巴細胞增殖的高低可以反映機體細胞免疫及體液免疫的水平。腹腔巨噬細胞具有高度的吞噬能力，不僅擔負著機體非特異性免疫的防御機能，而且有參與調(diào)節(jié)免疫應答的功能。而N K細胞是先天性免疫中一類十分重要的淋巴細胞，通過其細胞毒活性和產(chǎn)生淋巴因子，在機體抗感染、免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要的免疫功能。

本研究通過貫葉連翹提取物對流感病毒感染小鼠免疫器官質(zhì)量、T、B淋巴細胞的增殖功能、小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能和對N K細胞活性的影響，在一定程度上綜合反映了貫葉連翹提取物對流感病毒感染機體的細胞免疫、體液免疫和非特異性免疫能力的影響，體現(xiàn)整個機體免疫系統(tǒng)的功能水平。

結(jié)果顯示：貫葉連翹提取物與達菲作用于流感病毒感染小鼠后胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)有所回升，脾臟指數(shù)的增加更為顯著，與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。模型對照組的淋巴細胞增殖(包括T淋巴細胞增殖和B淋巴細胞增殖)較正常對照組降低(P＜0.01)，說明流感病毒感染能顯著抑制小鼠的淋巴細胞增殖，從而抑制機體免疫功能；而貫葉連翹提取物和達菲均能增加流感病毒感染小鼠N K細胞活性(P＜0.05)，提示貫葉連翹提取物可提高流感病毒感染小鼠的免疫功能狀態(tài)，并且以提高機體細胞免疫為主。同時也可看出：流感病毒感染小鼠后，模型對照組巨噬細胞的吞噬功能和N K細胞活性最小，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，說明流感病毒可明顯抑制小鼠巨噬細胞的吞噬功能和N K細胞的殺傷活性，采用貫葉連翹提取物和達菲干預后，吞噬功能和N K細胞殺傷活性較模型對照組有明顯提高(P＜0.01)，且與達菲相比差異顯著，提示貫葉連翹提取物同樣可明顯提高流感病毒感染小鼠非特異性免疫功能。

綜上所述，貫葉連翹提取物可明顯增強流感病毒感染小鼠的細胞免疫、體液免疫和非特異性免疫作用。

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The Influence of GuanYe LianQiao Extract on the Immunologic Function of Influenza Virus-infected Mice

XU Shanli1，PU Xiuying2△，YANG Xiaohua3，GUO Aijun3，YUE Lan3
1 The First People′s Hospital of Lanzhou City，Lanzhou 730050，China；2 School of Life Science and Engineering of Lanzhou University of Technology；3 The Hospital of Lanzhou University of Technology

Objective:To survey the effects of GuanYe LianQiao（Hypericum perforatum L.）extract on the immunologic function of influenza virus-infected mice.Methods:Forty mice were randomized into model control group，normal control group，tamiflu group （10 mg/kg），high and low dosage groups of GuanYe LianQiao extract，eight mice each group.Except normal control group，the mice in other groups were infected by dripping of influenza virus mice lung adaptive strain，and accepted the drenching of different herbs（high and low dosages of GuanYe LianQiao extract，100mg/kg and 50mg/kg，and tamiflu group，3mg/kg），0.2mL each time，twice per day，the eyeballs were taken out in five days and the mice were sacrificed，the thymus gland and the spleen were taken out，thymus index and spleen index were calculated；T and B lymphocyte transformation rates，phagocytic function of macrophage and killing activity of NK cells of the mice were determined before and after treating by adopting MTT method.Results:thymus index and spleen index raised after influenza virus-infected mice were given GuanYe LianQiao extract，there was significant difference compared with model control group （P＜0.05）；T and B lymphocyte transformation rates phagocytic function of macrophage and killing activity of NK cells raised obviously compared with model control group（P＜0.01）.Conclusion:GuanYe LianQiao extract shows certain immunoregulation effects to the influenza virus-infected mice.

influenza virus；immune organ index；phagocytic function；lymphocyte transformation rate；NK cell activity；GuanYe LianQiao extract

R285.6

A

1004-6852（2016）09-0023-05

2015-03-27

許珊麗（1967—），女，主任醫(yī)師。研究方向：心血管疾病的診治。

△通訊作者：蒲秀瑛（1968—），女，碩士研究生導師，博士學位，副教授。研究方向：藥理學和毒理學研究。