黃聰琳，郭 敏，王曉琳，姜 華

1甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州，730050；2甘肅省中醫(yī)藥研究院

一種改良的鐮形棘豆DNA提取方法*

黃聰琳1，2，郭 敏1，2，王曉琳1，2，姜 華2

1甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州，730050；2甘肅省中醫(yī)藥研究院

目的：建立適合DNA條形碼分析的鐮形棘豆DNA提取方法。方法：以鐮形棘豆（Oxytropis falcate Bunge）葉片為材料，采用改良的DNA提取方法對其DNA進行提取，并用瓊脂糖凝膠電泳和PCR擴增對提取的DNA進行檢測。結果：本方法提取的DNA，能夠滿足以PCR為基礎的分子鑒定的基本要求。操作簡便，需時短，成本低廉，適于DNA的大批量提取。結論：本方法適合DNA條形碼研究的DNA提取。

鐮形棘豆；DNA提?。籔CR擴增

DNA是重要的遺傳物質(zhì)，是中草藥的DNA條形碼鑒定、RAPD分析、PCR擴增、指紋圖譜等多方面分子生物學研究的基礎。尤其在大通量的分析中，快速獲得大量的DNA顯得極為重要。

傳統(tǒng)的提取植物的DNA方法有CTAB法［1］、SDS法、苯酚法等［2］，但操作步驟多，耗時長。試劑盒法提取DNA，純度高，但成本昂貴，不適合大批量提取。

棘豆屬(Oxytropis)植物為豆科較大的藥用屬之一［3］，其中鐮形棘豆(Oxytropis falcate Bunge)為豆科棘豆屬植物的干燥全草，主要產(chǎn)于我國青海、甘肅南部、四川西部，藏藥稱為“莪達夏”，現(xiàn)為《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準》(藏藥)第一冊收載品種［4］。該藥材總黃酮、生物堿等成分具有抗菌抗氧化、消炎止咳、抗腫瘤等活性［5-7］。

本研究探討適于DNA大批量提取的改良DNA提取方法對鐮形棘豆DNA進行提取，現(xiàn)將結果報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料 新鮮鐮形棘豆采自甘肅省甘南藏族自治州合作地區(qū)，經(jīng)蘭州大學生命科學學院副教授盛紅梅鑒定為鐮形棘豆。

1.2 主要試劑和儀器 三羥甲基氨基甲烷(Tris，天津市致遠化學試劑有限公司)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA，天津市光復精細化工有限公司)、十二烷基磺酸鈉(SDS，天津市光復精細化工有限公司)、鹽酸、氯化鈉、異丙醇等(天津市百世化工有限公司)均為分析純。低溫高速離心機(Eppendorf，德國)；恒溫水浴鍋(科哲，中國上海)；水平電泳儀(伯樂Bi o-Rad，美國)；凝膠成像系統(tǒng)(伯樂Bi o-Rad，美國)；PCR儀(伯樂Bi o-Rad，美國)。

1.3 方法

1.3.1 提取緩沖液配制 提取緩沖液配方見表1。

表1 提取緩沖液配方

1.3.2 DNA提取 1)稱取100 m g新鮮葉片，置滅菌Eppendorf管中，于20s內(nèi)迅速研磨成勻漿；2)加入400 μL提取緩沖液后，渦旋或劇烈振蕩5 s，然后放置室溫，待所有樣本處理完畢；3)13000r/m i n離心1分鐘；4)小心吸取300 μL上清液轉移入另一滅菌Eppendorf管，加入300 μL異丙醇，室溫擱置2分鐘；5)13000r/m i n離心5分鐘。棄去上清，室溫干燥；6)沉淀用100μL 1×TE或重蒸水溶解。

1.3.3 DNA檢測

1.3.3.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測 用瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的片段大小、降解情況及濃度。配制1.0%的瓊脂糖凝膠，取5μL DNA原液，與1μL 6×上樣緩沖液混勻，上樣，用DS 2000 Marker作為標準，120 V恒定電壓30分鐘后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.3.3.2 PCR擴增檢測 ITS2基因編碼一段核糖體DNA，被廣泛應用于物種的分子鑒定［8-10］，利用該基因的PCR擴增效果檢測所提取的DNA的質(zhì)量。PCR反應體系(25 μL)包括：10×緩沖液2.5μL，dN TP(2.5 m m ol/L)0.5μL，Taq聚合酶(5U/L) 0.5 μL，ITS2上下游引物(1 μm ol/L)各0.5 μL，ddH2O 20μL，模板DNA 0.5 μL。反應程序：94℃預變性5分鐘；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1分鐘，30個循環(huán)；72℃延伸5分鐘，4℃保存擴增產(chǎn)物。取5 μL PCR擴增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上水平電泳(120 V恒定電壓30分鐘)，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，引物序列見表2。

表2 引物及序列

2 結果

2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測 瓊脂糖凝膠電泳顯示，每個樣本都有1條高分子量條帶，植物總DNA條帶清晰可見，說明本法能夠提取相對完整的DNA，見圖1。

圖1 提取的新鮮鐮形棘豆基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 PCR擴增 以本法提取的DNA為模板，進行PCR擴增，均獲得了清晰的擴增條帶。從瓊脂糖凝膠電泳看，提取的總DNA雖然有部分降解，但以ITS2引物進行PCR擴增，能夠得到清晰的目的條帶，說明提取的DNA完全可以作為PCR的模板使用，見圖2。

圖2 PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

3 討論

在植物藥材的分子鑒定、作物的分子育種、突變體篩選等研究中，通常需要大樣本量的DNA，本法操作簡單、方便，可以快速獲得植物總DNA。在諸多需要通過PCR擴增進行檢測鑒定的研究工作中，此法提取的DNA質(zhì)量足以作為PCR模板使用。在成本方面遠低于試劑盒提取法。另外，本方法避免使用酚、氯仿、高氯酸鈉、異硫氰酸胍等有毒有機試劑，減少了人體傷害和環(huán)境污染。提取的總DNA通過瓊脂糖凝膠電泳和PCR擴增檢測，結果表明本法提取的新鮮鐮形棘豆基因組DNA能滿足普通的PCR擴增實驗，可用于大批量新鮮中草藥，尤其是葉片樣本的DNA提取。

本方法的特點是：1)操作簡便，在室溫條件操作即可；2)需時很短，全部操作在1個小時內(nèi)即可完成；3)可以用于多種新鮮植物組織DNA提取，尤其對于幼嫩葉片，效果更佳；4)分離效果好，多數(shù)情況提取的DNA純度都較理想，完全可以滿足PCR擴增的模板要求。

［1］Doyle JJ.A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue［J］.Phytochem Bull，1987，19：11-15.

［2］孫璐宏，魯周民，張麗.植物基因組DNA提取與純化研究進展［J］.西北林學院學報，2010，25（6）：102-106.

［3］劉斌.中國棘豆屬藥用植物及其現(xiàn)代研究［J］.中國野生植物資源，1997，16（2）：15-18.

［4］中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準（藏藥）第一冊［M］.北京：中華人民共和國衛(wèi)生部，1995：101.

［5］Jiang H，Hu JR，Zhan WQ，et al.Screening for fractions of oxytropis falcata bunge with antibacterial ac-tivity［J］.Natural Product Research，2009，23（10）：953-959.

［6］姜華，張麗，黃聰琳，等.藏藥鐮形棘豆總黃酮苷元急性毒性實驗研究［J］.西部中醫(yī)藥，2013，26（8）：50-52.

［7］王棟，楊歡，童麗，等.藏藥鐮形棘豆的鎮(zhèn)痛抗炎活性［J］.藥學與臨床研究，2008，16（2）：90-93.

［8］CPB Group，Li DZ，Gao LM，et al.Comparative analysis of a largedataset indicates that internal transcri bed spacer（ITS）should be incorporated into the corebarcode for seed plants［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2011，108（49）：19641-19646.

［9］石林春，陳俊，向麗，等.基于ITS2條形碼的中藥材天南星及其混偽品DNA分子鑒定［J］.中國中藥雜志，2014，39（12）：2176-2179.

［10］趙莎，龐曉慧，宋經(jīng)元，等.應用ITS2條形碼鑒定中藥材合歡皮、合歡花及其混偽品［J］.中國中藥雜志，2014，39（12）：2164-2168.

A Modified DNA Extraction for LianXing JiDou

HUANG Conglin1，2，GUO Min1，2，WANG Xiaolin1，2，JIANG Hua2
1 Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730050，China；2 Gansu Provincial Academy of Chinese Medicine

Objective:To establish a DNA extraction method from LianXing JiDou （Oxytropis falcate Bunge）for DNA bar code analysis.Methods:Leaves of LianXing JiDou were used to extract DNA by using a modified DNA method；agarose gel electrophoresis and PCR amplification were used to detect extracted DNA.Results:The DNA extracted by this method could meet basic requirements for PCR molecular identification.The method is simple，time-saving，and low-cost；it is suitable for extraction in large quantities.Conclusion:This method is a proper method of DNA extraction for bar code analysis.

LianXing JiDou；DNA extraction；PCR amplification

R285.2

A

1004-6852（2016）09-0034-03

2015-06-25

甘肅省中醫(yī)藥科研立項課題（編號G ZK-2012-71）；甘肅省中醫(yī)院博士啟動基金項目（編號博2013-9）。

黃聰琳（1983—），女，博士學位，助理研究員。研究方向：藥用植物分子生物學。