尹柏雙，付連軍，王雪瑩，趙麗榮，李　娟，馮　雪，莊　蒙

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院，吉林 吉林 132101）

鹿特異性復(fù)合麻醉劑對大鼠不同腦區(qū)GLU和ASP含量的影響

尹柏雙，付連軍，王雪瑩，趙麗榮，李娟，馮雪，莊蒙

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院，吉林 吉林 132101）

為了研究鹿特異性復(fù)合麻醉劑麻醉下大鼠不同腦區(qū)興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化，探討鹿特異性復(fù)合麻醉劑的中樞作用的可能機(jī)理。將32只SD大鼠隨機(jī)分成對照組、誘導(dǎo)組、麻醉組、蘇醒組，采用反向高效液相色譜法測定各腦區(qū)GLU和ASP的含量。結(jié)果顯示，腹腔注射鹿特異性復(fù)合麻醉劑30 mg/kg體重后，誘導(dǎo)組大鼠大腦、小腦、腦干和海馬GLU和ASP含量與對照組比較降低顯著（P＜0.05或P＜0.01）；麻醉組大腦、小腦、腦干和海馬GLU和ASP含量顯著低于對照組（P＜0.01）；蘇醒組小腦和腦干GLU和海馬中的ASP與對照組比較差異仍顯著（P＜0.05）。麻醉全程，丘腦內(nèi)GLU含量與對照組比較差異不顯著（P＞0.05）。表明鹿特異性復(fù)合麻醉劑的中樞作用，可能與降低大腦、小腦、腦干和海馬內(nèi)的GLU、ASP和丘腦內(nèi)的ASP含量有關(guān)。

鹿特異性復(fù)合麻醉劑；不同腦區(qū)；天門冬氨酸；谷氨酸；高效液相色譜

GLU和ASP對大腦皮質(zhì)細(xì)胞有普遍而強(qiáng)烈的興奮作用，是中樞神經(jīng)遞質(zhì)，研究表明，多發(fā)性抽動癥發(fā)病過程與興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)水平異常有密切關(guān)系［1］。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，而谷氨酸能神經(jīng)元的傳遞與學(xué)習(xí)記憶、中樞痛覺有關(guān)，在麻醉作用機(jī)制和麻醉藥神經(jīng)保護(hù)中具有重要作用［2］。20世紀(jì)80年代初研制成功的谷氨酸專一性抗血清，證實在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)絕大多數(shù)興奮性突觸都是以谷氨酸為遞質(zhì)。興奮性氨基酸如谷氨酸、天門冬氨酸，在腦缺血再灌注損傷后發(fā)生的延遲性神經(jīng)元死亡中處于十分關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。腦缺血后細(xì)胞外液中興奮性氨基酸尤其是谷氨酸濃度的增高是缺血后再灌注損傷級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，腦缺血可使其在細(xì)胞外大量積聚，產(chǎn)生興奮毒性［3］。癲癇、創(chuàng)傷、痙攣和一些神經(jīng)退行性疾病中發(fā)生神經(jīng)元凋亡，都有谷氨酸的神經(jīng)毒性的作用［4］。研究報道，腦區(qū)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量變化與麻醉劑引起麻醉現(xiàn)象密切相關(guān)［5］。孫緒德等對安氟醚麻醉機(jī)理的研究表明，安氟醚麻醉能夠抑制谷氨酸的釋放，使谷氨酸在丘腦部位顯著降低，與清醒狀態(tài)比較，麻醉后谷氨酸在皮層運(yùn)動區(qū)等5個區(qū)域也有明顯的降低［6］。多種麻醉藥對興奮性類神經(jīng)遞質(zhì)的釋放過程影響不完全相同，具有較強(qiáng)的選擇性，但都是使突觸前膜ASP和GLU釋放的減少和攝取的增多而達(dá)到麻醉效果［9-13］。

本試驗通過研究鹿特異性復(fù)合麻醉劑對大鼠不同腦區(qū)GLU和ASP的含量的影響，來分析麻醉制劑的中樞突觸前麻醉機(jī)理，為麻醉劑的深入研究奠定基礎(chǔ)，為鹿生產(chǎn)實踐過程中提供切實可行的保定和麻醉方法。

1　材料與方法

1.1試驗材料鹿特異性復(fù)合麻醉劑由本試驗自行研制（有賽拉嗪、強(qiáng)痛寧組合）；GLU標(biāo)準(zhǔn)品、ASP標(biāo)準(zhǔn)品和2，4-二硝基氟苯，購自南京森貝伽生物科技有限公司；色譜級甲醇、色譜級乙腈，購自Sigma公司；高效液相色譜系統(tǒng)，C18（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱為日本島津公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)為Sigma公司；成年大鼠32只，體重200±20 g，雌雄各半，由吉林大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2實驗動物分組隨機(jī)取8只成年大鼠為生理鹽水對照組，其余大鼠被隨機(jī)分成誘導(dǎo)組（注射藥物后第5 min）、麻醉組（翻正反射消失后10 min）、蘇醒組（翻正反射恢復(fù)即刻）。對照組大鼠腹腔注射生理鹽水0.3 mL/kg體重，試驗組大鼠腹腔注射鹿特異性復(fù)合麻醉劑30 mg/kg體重。

1.3樣品的采集和處理對照組大鼠在腹腔注射0.3 mL/kg體重生理鹽水溶液后8 min，誘導(dǎo)組、麻醉組、蘇醒組大鼠分別在相應(yīng)時間點斷頭處死、取腦，在冰面上迅速分離大腦、丘腦、小腦、海馬、腦干，分別稱重后液氮冷凍。

將腦組織取出放入勻漿器中，加入9倍體積的甲醇/水（V/V=50∶50），手動勻漿數(shù)次后將勻漿液注入EP管中；-4℃高速離心30 min（3 000 r/ min），上清液倒入另一個EP管中低溫保存腦組織液。取上清液400 μL，加入400 μL乙腈，混勻，-4℃高速離心10 min（15 000 r/min），取上清液加入0.5 mol/L NaHCO3溶液400 μL，再加入0.5%2，4-二硝基氟苯200 μL，混勻，恒溫水浴鍋中衍生55 min（水浴65℃），進(jìn)樣20 μL［11］。

1.4檢測條件色譜柱：C18（4.6×200 mm，5 μm）；流動相：A為0.05 mol/L的醋酸鈉緩沖液（pH值= 6.0，B為乙腈/水，V/V=50∶50），進(jìn)行梯度洗脫，流動相B的濃度由初始時16%經(jīng)10 min增至45%，18 min至85%；流速：1 mL/min；檢測波長：350 nm；柱溫：28℃。取20 μL進(jìn)樣分析，采用外標(biāo)法定量。

1.5統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-X±s）表示，用SPSS 17.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間比較采用t檢驗進(jìn)行。

2　結(jié)果與分析

2.1鹿特異性復(fù)合麻醉劑對大鼠不同腦區(qū)GLU含量的影響如表1所示，大鼠腹腔注射30 mg/kg體重的復(fù)合麻醉劑后，誘導(dǎo)組大鼠大腦、小腦、腦干和海馬內(nèi)GLU含量與對照組比較顯著降低，分別降低了 27.98%（P＜0.01）、15.19%（P＜0.05）、18.12%（P＜0.05）和17.37%（P＜0.05）；麻醉組大腦、小腦、海馬和腦干內(nèi)GLU含量與對照組比較，分別降低了 39.50%（P＜0.01）、34.50%（P＜0.01）、34.13%（P＜0.01）和31.95%（P＜0.01）。蘇醒組小腦和腦干內(nèi)GLU含量與對照組比較差異仍顯著，分別降低了13.24%（P＜0.05）和13.26%（P＜0.05）。

2.2鹿特異性復(fù)合麻醉劑對大鼠不同腦區(qū)ASP含量的影響由表2可見，大鼠腹腔注射30 mg/kg體重的復(fù)合麻醉劑后，誘導(dǎo)組大腦內(nèi)ASP含量與對照組比較降低了33.38%（P＜0.01）差異極顯著，小腦、丘腦、腦干和海馬內(nèi)ASP含量與對照組比較分別降低了14.86%（P＜0.05）、8.32%（P＜0.05）、18.75%（P＜0.05）和19.85%（P＜0.05）；麻醉組大腦、小腦、丘腦、腦干和海馬內(nèi)ASP含量與對照組比較，分別降低了52.27%（P＜0.01）、28.94%（P＜0.01）、19.58%（P＜0.01）、33.19%（P＜0.01）和33.46%（P＜0.01），差異均極顯著。蘇醒組海馬內(nèi)ASP含量與對照組比較差異仍顯著，降低了16.17%（P＜0.05）和13.26%（P＜0.05）。

表1　復(fù)合麻醉劑對大鼠不同腦區(qū)GLU含量的影響?。╣/mL）

3　討論

過去研究表明，全麻藥主要影響突觸傳遞功能，產(chǎn)生麻醉作用，臨床常用劑量的吸入和靜脈全麻藥均可降低興奮性突觸前膜釋放興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，使興奮性突觸后電位幅度降低，衰減速度加快，從而引起興奮性神經(jīng)遞質(zhì)減少，產(chǎn)生麻醉現(xiàn)象［6］。Masatou認(rèn)為靜脈麻醉藥引起K+誘導(dǎo)的谷氨酸釋放減少，抑制突觸傳遞，產(chǎn)生麻醉現(xiàn)象［7］。尹柏雙等提出全麻藥作用確切的位點可能是神經(jīng)突觸的受體、離子通道或其相應(yīng)的調(diào)控系統(tǒng)，其中影響突觸的電-化學(xué)傳遞過程可能是全麻作用的關(guān)鍵［8］。

表2　復(fù)合麻醉劑對大鼠不同腦區(qū)ASP含量的影響?。╣/mL）

興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)與麻醉機(jī)理關(guān)系的研究有很多，但結(jié)果不一。李小蕾等研究表明，海馬、丘腦、小腦和腦干是氯胺酮引起小型豬興奮性神經(jīng)遞質(zhì)變化的主要作用部位［9］；周穎等研究表明，異丙酚使皮質(zhì)區(qū)、丘腦區(qū)、海馬區(qū)和紋狀體區(qū)谷氨酸和天門冬氨酸水平降低，可能是其麻醉的中樞機(jī)制之一［10］。尹柏雙等研究表明，鹽酸塞拉嗪降低小腦、丘腦、大腦皮質(zhì)、海馬腦區(qū)內(nèi)ASP水平，降低丘腦、海馬腦區(qū)內(nèi)GLU水平，是其產(chǎn)生全身麻醉作用的重要機(jī)理［11］；李曉蕾等研究表明，塞拉嗪通過抑制海馬、丘腦和腦干內(nèi)神經(jīng)突觸釋放GLU、ASP和抑制大腦、小腦內(nèi)ASP與受體的結(jié)合而產(chǎn)生麻醉作用［12］；張燕等研究表明，噻環(huán)乙胺及XFM麻醉與大腦皮層、海馬、丘腦、小腦和腦干內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)釋放關(guān)系密切［13］。綜上研究表明，雖然各種全麻藥物對突觸前膜作用機(jī)制存在不同，但都是使突觸前膜ASP和GLU釋放的減少和攝取的增多，表明了抑制興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和攝取可能是麻醉藥物發(fā)揮作用的重要機(jī)制。

鹿作為反芻動物因自身的生理特點，麻醉過程中存在多種影響因素，這些因素導(dǎo)致我國每年鹿的死亡率較高，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。鹿特異性復(fù)合麻醉劑是利用平衡麻醉理論，由賽拉嗪、強(qiáng)痛寧等多種藥物復(fù)合而成的鹿專用特異性復(fù)合麻醉劑。臨床監(jiān)測表明，該藥物具有誘導(dǎo)迅速、安全范圍大、復(fù)蘇平穩(wěn)、麻醉效果確實等優(yōu)點。本試驗針對鹿特異性復(fù)合麻醉劑的中樞作用機(jī)制進(jìn)行研究，結(jié)果表明，大鼠腹腔注射臨床劑量的鹿特異性復(fù)合麻醉劑后，大腦、小腦、腦干和海馬內(nèi)的GLU和ASP含量顯著降低，麻醉全程，丘腦內(nèi)GLU含量無顯著變化。

4　結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，鹿特異性復(fù)合麻醉劑引起大腦、小腦、腦干和海馬內(nèi)GLU和ASP含量的降低可能是其產(chǎn)生麻醉作用的重要機(jī)理之一。鹿特異性復(fù)合麻醉劑的中樞作用，可能與降低大腦、小腦、腦干和海馬內(nèi)的GLU、ASP和丘腦內(nèi)的ASP含量有關(guān)。

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S854.5+4

B

0529-6005（2016）04-0119-03

2014-06-10

吉林省科技廳發(fā)展計劃項目（20140204062NY）；吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)項目（吉教科合字2014379）；長白山動植物資源保護(hù)與利用省級重點實驗室基金項目（吉農(nóng)院合字2012701，2013S029）；吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院博士啟動基金項目（吉農(nóng)院合字2012307）；吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院種子基金項目（吉農(nóng)院合字2013905），大學(xué)生科技創(chuàng)新項目（吉農(nóng)院合字2013036）

尹柏雙（1978-），男，副教授，博士，從事麻醉與鎮(zhèn)痛研究，E-mail：ybs3421@126.com