陳申秒，牛成明，翟慶賀，何福慶，楊靈芝

（1.山東濱州沃華生物工程有限公司，山東 濱州 256600；2.山東博萊威生物技術(shù)研究所，山東 濱州 256606）

豬流行性腹瀉病毒培養(yǎng)的工藝參數(shù)優(yōu)化試驗(yàn)

陳申秒1，2，牛成明1，2，翟慶賀2，何福慶2，楊靈芝1，2

（1.山東濱州沃華生物工程有限公司，山東 濱州 256600；2.山東博萊威生物技術(shù)研究所，山東 濱州 256606）

為了提高豬流行性腹瀉病毒的病毒滴度，建立最優(yōu)的病毒培養(yǎng)條件，對影響病毒培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間、接毒劑量、收毒時(shí)間等條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為主要因素，對于流行性腹瀉病毒毒價(jià)影響較為顯著，細(xì)胞培養(yǎng)72 h接毒平均毒價(jià)為107.44TCID50/0.1 mL，均高于其他兩組；而收毒時(shí)間則為次要因素，平均毒價(jià)為107.21TCID50/0.1 mL；接毒劑量影響不顯著，平均毒價(jià)為107.08TCID50/0.1 mL，本試驗(yàn)最佳工藝組合為細(xì)胞培養(yǎng)72 h接毒、接毒劑量為0.1%、收毒時(shí)病變程度為60%。

豬流行性腹瀉病毒；細(xì)胞培養(yǎng)；佐劑

使用PEDV滅活疫苗是目前防治豬流行性腹瀉的主要手段，但目前市場上的滅活疫苗普遍反映效果不理想，主要原因在于病毒培養(yǎng)難度大，病毒抗原很難達(dá)到很高的水平。有試驗(yàn)表明，如果乳汁中有高水平的IgG可以保護(hù)仔豬免受感染，這要求妊娠母豬免疫肌肉注射劑量每次不應(yīng)少于107.0TCID50/mL，而且應(yīng)進(jìn)行兩次免疫才能激發(fā)產(chǎn)生高水平中和抗體［1］。我國很早就在Vero細(xì)胞上培養(yǎng)PEDV，但是其來源的差異、毒株間的差異及培養(yǎng)條件對于PEDV的分離培養(yǎng)影響很大，不同學(xué)者所報(bào)道的方法在胰酶濃度、培養(yǎng)時(shí)間等方面差距較大［2］，建立高病毒含量的生產(chǎn)工藝在實(shí)際生產(chǎn)中意義重大。為進(jìn)一步優(yōu)化生產(chǎn)工藝、提高半成品毒價(jià)，本研究從細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間、接毒劑量、收毒時(shí)間入手，研究三個(gè)因素對于半成品毒價(jià)影響的主次關(guān)系，以期篩選到最佳工藝組合，為腹瀉發(fā)生提供依據(jù)。

1　試驗(yàn)材料

1.1細(xì)胞傳代后48 h大轉(zhuǎn)瓶Vero細(xì)胞，共18瓶，由滅活細(xì)胞苗車間提供。

1.2種毒PEDV-CV777 F79（F4），生產(chǎn)種毒，毒價(jià)為107.6TCID50/0.1 mL，-70℃保存，批號為140107；

1.3其他耗材MEM MD600，購自北京清大天一科技有限公司；新生牛血清，購自濟(jì)南勁牛；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板等。轉(zhuǎn)瓶機(jī)，微量移液器，37℃溫室，細(xì)胞培養(yǎng)箱等。

2　試驗(yàn)方法

2.1腹瀉培養(yǎng)工藝的優(yōu)化選取Vero細(xì)胞長至較密單層的大轉(zhuǎn)瓶6個(gè)，按照1∶3比例，均勻傳至18個(gè)大轉(zhuǎn)瓶，待細(xì)胞長至單層后備用。將18個(gè)大轉(zhuǎn)瓶Vero細(xì)胞隨機(jī)分組，按照正交試驗(yàn)表分組接毒，共分為9組，每組2個(gè)重復(fù)。

表1　腹瀉工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

接毒后逐日觀察細(xì)胞病變情況，按照細(xì)胞病變的程度分別收獲，凍融2次后，取樣，用于毒價(jià)測定。大轉(zhuǎn)瓶接毒工藝：選取長至需要時(shí)間的大轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞，棄去營養(yǎng)液，加入2%血清的MEM［含終濃度為100 IU（μg）/mL的雙抗］，1 000 mL/瓶，加入需要?jiǎng)┝康姆N毒（如1%接毒劑量，即加入10 mL種毒/瓶），搖勻，置于37℃培養(yǎng)，24 h后隨時(shí)觀察病變情況，當(dāng)病變程度達(dá)到要求比例時(shí)（如90%細(xì)胞發(fā)生病變），收取大轉(zhuǎn)瓶，置于-20℃凍存，凍融2次，取樣，用于毒價(jià)測定。

2.2病毒毒價(jià)的測定按照常規(guī)方法培養(yǎng)Vero細(xì)胞，將細(xì)胞消化后鋪于5塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，待長滿單層，棄去培養(yǎng)液，取維持液稀釋好的病毒樣品，10-5至10-8稀釋度，加入上述96孔板內(nèi)，每個(gè)稀釋度6個(gè)重復(fù)，每孔100 μL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)96 h，逐日觀察，記錄病變情況，計(jì)算TCID50。

測定結(jié)束后，再對樣品進(jìn)行1次重復(fù)測定，若兩次測定結(jié)果吻合，則分析數(shù)據(jù)，得出結(jié)論；反之，則需進(jìn)行第3次重復(fù)測定。

3　試驗(yàn)結(jié)果

3.1接毒病變及毒價(jià)測定情況按照方案，分別于細(xì)胞傳代后24、48、72 h接毒，并按照不同的病變程度收毒，取樣后進(jìn)行兩次毒價(jià)測定，對于兩次毒價(jià)測定結(jié)果差異較大樣品，分別重新測定兩次，最后取毒價(jià)指數(shù)平均值，作為該樣品的毒價(jià)。具體數(shù)據(jù)見表2、圖1。

3.2結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析利用極差分析方法，對細(xì)胞傳代后不同時(shí)間、接毒劑量、病變程度等組合的累加毒價(jià)、平均毒價(jià)進(jìn)行計(jì)算，進(jìn)而計(jì)算各組內(nèi)平均毒價(jià)的最大差距，即極差數(shù)值（R），并根據(jù)各組間極差的大小，判定主次因素對于毒價(jià)的影響程度，結(jié)果顯示：細(xì)胞傳代培養(yǎng)時(shí)間R值為0.41，大于病變程度的R值（0.35），大于接毒劑量的R值（0.27）。因此，對于毒價(jià)影響的主次因素依次為細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間、病變程度、接毒劑量。

表2　各分組接毒、收毒及毒價(jià)測定情況

圖1　不同試驗(yàn)組的平均毒價(jià)分布

利用SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果與極差分析結(jié)果一致。細(xì)胞培養(yǎng)72、48 h均顯著高于24 h；病變在60%時(shí)收毒，顯著好于90%；接毒劑量為0.01%時(shí)，略好于其他接毒劑量，但差異不顯著。

通過上述分析，最佳組合方案為細(xì)胞傳代后72 h接毒、接毒劑量為0.01%、病變在60%時(shí)收毒，預(yù)期毒價(jià)較好。具體統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表3、圖2。

表3　正交試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析

圖2　不同條件下毒價(jià)均值分布情況

4　討論

由上述試驗(yàn)結(jié)果可知，細(xì)胞培養(yǎng)144 h接毒，對于腹瀉病毒毒價(jià)的影響較大。這表明，細(xì)胞密度對于腹瀉病毒的大量增殖是必要的。因此，提高腹瀉病毒毒價(jià)，關(guān)鍵是提高Vero細(xì)胞的培養(yǎng)密度。那么提高培養(yǎng)密度，除延長細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間外，還可以通過增大細(xì)胞培養(yǎng)面積的方法，例如生物反應(yīng)器。

此外，在Vero細(xì)胞的傳代培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)所用Vero細(xì)胞系中存在兩種形態(tài)的細(xì)胞，即馬賽克形和梭形（類似柳葉性狀）。其中，梭形Vero細(xì)胞生長較為迅速、且后期細(xì)胞密度較大，對于腹瀉病毒增殖較為有利；而馬賽克形的細(xì)胞則增殖較為緩慢，且后期細(xì)胞密度相對較低，對于腹瀉病毒增殖可能不利，具體情況還得進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)。

5　結(jié)論

本試驗(yàn)最佳工藝組合為細(xì)胞培養(yǎng)72 h接毒，接毒劑量為0.1%，收毒時(shí)病變程度為60%；優(yōu)勢組合為：細(xì)胞培養(yǎng)72 h接毒，接毒劑量為10%，收毒時(shí)病變程度為75%；細(xì)胞培養(yǎng)48 h接毒，接毒劑量為0.1%，收毒時(shí)病變程度為75%。

［1］Calvo E，Escors D，Lopez J A，et al.Phosphorylation and subcellularlocalization of transmissible gastroenteritis virus nucleocapsideprotein in infected cell［J］.J Gen Virol，2005，86：2255-2267.

［2］陳申秒，牛成明，何福慶，等.豬流行性腹瀉病毒研究進(jìn)展及疫苗研究前景［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（3）：223-229.

S852.65+1

B

0529-6005（2016）04-0117-02

2014-12-01

山東省自主創(chuàng)新成果轉(zhuǎn)化重大專項(xiàng)（2010ZHZX1A 0417）

陳申秒（1983-），男，助理研究員，碩士，從事動物傳染病的診斷與防治工作，E-mail：csmiao.science@163.com