張偉愛(ài)，王 剛，馬彩娟，蘇政權(quán)，白 研

（廣東藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州 510310）

殼聚糖-活性紅4締合體系的熒光猝滅與共振瑞利散射光譜分析及其在殼聚糖定量分析中的應(yīng)用

張偉愛(ài)，王 剛，馬彩娟，蘇政權(quán)，白 研*

（廣東藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州 510310）

在弱酸性Britton-Robinson緩沖體系中，殼聚糖對(duì)活性紅4存在熒光猝滅作用，在激發(fā)波長(zhǎng)（λEx）/發(fā)射波長(zhǎng)（λEm）=285 nm/341 nm處，在0.050～2.00 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其熒光猝滅程度與殼聚糖質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。線性方程為ΔF=68.78c+2.648（c，μg/mL），R2=0.999 2，檢出限為0.039 μg/mL。在相同的介質(zhì)環(huán)境中，殼聚糖-活性紅4離子締合體系于波長(zhǎng)342 nm處產(chǎn)生強(qiáng)烈的共振瑞利散射特征峰，共振瑞利散射強(qiáng)度與殼聚糖質(zhì)量濃度c呈良好線性關(guān)系，在0.050～6.00 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性方程為：ΔI=681.31c+114.95（c，μg/mL），R2=0.999 1，檢測(cè)限為0.033 μg/mL。據(jù)此，建立以活性紅4為探針定量分析殼聚糖的2 種新方法：熒光猝滅法和共振瑞利散射法。同時(shí)，將2 種方法就殼聚糖分子質(zhì)量對(duì)測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性的影響進(jìn)行研究。將2 種新方法應(yīng)用于實(shí)際量品的定量檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果基本一致，且回收率結(jié)果令人滿意。

殼聚糖；活性紅4；熒光猝滅法；共振瑞利散射法

張偉愛(ài)， 王剛， 馬彩娟， 等. 殼聚糖-活性紅4締合體系的熒光猝滅與共振瑞利散射光譜研究及其在殼聚糖定量分析中的應(yīng)用［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（8）: 176-181. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608031. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Weiai， WANG Gang， MA Caijuan， et al. Fluorescence quenching and resonance Rayleigh scattering spectra of chitosan-Cibacron brilliant red 3B-A association system and its application for the determination of chitosan［J］. Food Science， 2016， 37（8）: 176-181. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608031. http://www.spkx.net.cn

殼聚糖是甲殼素脫乙酰基產(chǎn)物，其化學(xué)名稱為聚葡萄糖胺（1，4）-2-氨基-2-脫氧-D-葡聚糖，是自然界含量?jī)H次于纖維素的第二大天然有機(jī)高分子化合物［1］。甲殼素是甲殼類（蝦、蟹）動(dòng)物、昆蟲(chóng)的外骨骼的主要成分。殼聚糖及其衍生物是重要的生物活性物質(zhì)，具有抗腫瘤［2］、抗凝血［3］、減肥降脂［4-5］和增強(qiáng)免疫力［6］等功能，可作為醫(yī)藥保健品、保健食品的重要原料。

隨著殼聚糖在功能性食品中的廣泛應(yīng)用，殼聚糖的準(zhǔn)確定量顯得十分重要。目前，國(guó)內(nèi)外用于殼聚糖定量分析的方法主要集中在分光光度法［7-9］和分子熒光法［10-12］。共振瑞利散射法應(yīng)用于殼聚糖定量分析的研究很少［13-14］。目前，光譜分析法定量分析殼聚糖普遍忽視了殼聚糖作為高分子天然產(chǎn)物，其相對(duì)分子質(zhì)量可能從幾千到百萬(wàn)不等，當(dāng)未知量品中殼聚糖相對(duì)分子質(zhì)量與殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)差異較大時(shí)，可能會(huì)產(chǎn)生一定的系統(tǒng)誤差，影響準(zhǔn)確定量，而此方面研究目前還處于空白。

本實(shí)驗(yàn)深入研究了在弱酸環(huán)境中殼聚糖與活性紅4結(jié)合后的光譜特征，研究［15-17］發(fā)現(xiàn)，殼聚糖能使活性紅4的熒光強(qiáng)度產(chǎn)生規(guī)律性猝滅，并產(chǎn)生了規(guī)律性增強(qiáng)的共振瑞利散射特征峰，據(jù)此在分光光度法之外，又建立了2 種定量分析殼聚糖的新方法。同時(shí)，本研究結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析考察殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)在不同分子質(zhì)量的情況下對(duì)量品測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性的影響，提出了量品中殼聚糖更為準(zhǔn)確定量的方法。將2 種新方法應(yīng)用于市售殼聚糖功能食品中殼聚糖的定量分析，檢測(cè)結(jié)果基本一致。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

殼聚糖膠囊（奧利維） 威海南波灣生物技術(shù)有限公司；殼聚糖膠囊（艾得蘭） 上海同濟(jì)生物制品有限公司；殼聚糖對(duì)照品（低分子質(zhì)量：黏度≤200 mPa·s；中分子質(zhì)量：黏度200～400 mPa·s；高分子質(zhì)量：黏度400～1 000 mPa·s；1%溶解在體積分?jǐn)?shù)1%醋酸溶液中，20 ℃）、活性紅4染料 美國(guó)Sigma公司。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)貯備液：準(zhǔn)確稱取0.04 g殼聚糖溶于HAc（0.5 mol/L）溶液中，容量瓶定容至100 mL，得到質(zhì)量濃度為400.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（10.00 μg/mL）：吸取殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)貯備液2.50 mL于100 mL容量瓶中，以水定容到刻度，臨用前制備。

活性紅4操作液（1.00×10-4mol/L）：精密稱取0.025 0 g活性紅4染料，用水溶解，于250 mL容量瓶中定容，搖勻，備用。

Britton-Robinson（B-R）緩沖溶液：由0.04 mol/L混合酸（（2.71 mL正磷酸+2.36 mL冰乙酸+2.47 g硼酸）/L）與0.2 mol/L NaOH溶液按不同比例配制而成。

1.2儀器與設(shè)備

F-2500型熒光分光光度計(jì)、UV-3010紫外分光光度計(jì)日本日立公司；PHS-3C型精密酸度計(jì) 上海虹益儀器儀表公司；CP124C萬(wàn)分之一電子天平 上海奧豪斯有限公司。

1.3方法

1.3.1熒光猝滅法

在一系列10 mL比色管中，依次加入適量的殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液或量品操作液、pH4.50的B-R緩沖溶液2.00 mL、活性紅4操作液1.00 mL，以水定容至刻度線，搖勻。用1 cm石英比色皿，在激發(fā)波長(zhǎng)（λEx）/發(fā)射波長(zhǎng)（λEm）= 285 nm/341 nm處，測(cè)定各測(cè)試液的熒光強(qiáng)度F，以及對(duì)應(yīng)試劑空白的熒光強(qiáng)度F0，計(jì)算ΔF=F0-F。

1.3.2共振瑞利散射法

在一系列10 mL比色管中，依次加入適量的殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液或者量品操作液、pH5.50的B-R緩沖溶液2.00 mL、活性紅4操作液1.00 mL，以水定容，搖勻，放置10 min。在F-2500熒光分光光度計(jì)上，選擇激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm，以λEx=λEm進(jìn)行同步掃描，記錄共振瑞利散射光譜，并于波長(zhǎng)342 nm處分別測(cè)量各測(cè)試液的共振瑞利散射光強(qiáng)度I，以及試劑空白的I0，計(jì)算ΔI=I-I0。

2　結(jié)果與分析

2.1光譜分析

于10 mL比色管中，加入適量的殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后加入pH4.50的B-R緩沖溶液2.00 mL，活性紅4操作液1.00 mL，以水定容至刻度，搖勻。分別掃描該測(cè)試液的紫外-可見(jiàn)吸收光譜、激發(fā)光譜、熒光光譜以及共振瑞利散射光譜，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1　殼聚糖-活性紅4體系的吸收光譜、熒光光譜以及共振瑞利散射光譜Fig.1 UV spectra， fluorescence spectra and RRS spectra of chitosan-Cibacron brilliant red 3B-A system

由圖1可知，殼聚糖-活性紅4在λEx=285 nm、熒光波長(zhǎng)341 nm處有最大熒光值，激發(fā)光譜和熒光光譜成鏡像對(duì)稱關(guān)系，判斷熒光圖譜應(yīng)為第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)所形成的峰，干擾較少，峰值高。且激發(fā)光譜與紫外吸收光譜吸收峰位置有較好的重疊，說(shuō)明在殼聚糖與活性紅4之間發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移。

殼聚糖-活性紅4的共振瑞利散射峰位于殼聚糖-活性紅4體系的吸收光譜帶，此處由于該離子締合物電子吸收電磁波的頻率與散射頻率相同，電子因共振而強(qiáng)烈吸收光能并再次散射，從而產(chǎn)生強(qiáng)烈的共振瑞利散射，其散射強(qiáng)度比單純的瑞利散射提高幾個(gè)數(shù)量級(jí)［18］。

熒光光譜位置與共振瑞利散射的最大散射位置有較大重疊，這也意味著在相同頻率條件下，在殼聚糖與活性紅4之間互相產(chǎn)生共振和能量交換，導(dǎo)致共振瑞利散射增強(qiáng)，其熒光發(fā)生相應(yīng)的猝滅［19］。

2.2熒光光譜

圖2　不同殼聚糖質(zhì)量濃度時(shí)的熒光圖譜Fig.2 Fluorescence spectra of Cibacron brilliant red 3B-A system

2.3熒光猝滅方式

熒光猝滅過(guò)程分為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅2 種，靜態(tài)猝滅是由于猝滅劑與熒光體分子在基態(tài)形成不發(fā)光的配合物或分子間復(fù)合物［20］，從而導(dǎo)致熒光體發(fā)光強(qiáng)度降低的過(guò)程；動(dòng)態(tài)猝滅是猝滅劑與熒光體激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用過(guò)程，該過(guò)程遵從Stern-Volmer方程［21-22］：

式中：F0為未加猝滅劑的測(cè)試液熒光強(qiáng)度；F為加入猝滅劑的測(cè)試液熒光強(qiáng)度；KSV為猝滅常數(shù)/（mL/μg）；［Q］為猝滅劑殼聚糖的質(zhì)量濃度/（μg/mL）。

按照1.3.1節(jié)，檢測(cè)了3 種不同溫度條件下，不同殼聚糖質(zhì)量濃度時(shí)測(cè)試液的熒光強(qiáng)度F，以及對(duì)應(yīng)空白的熒光強(qiáng)度F0，以F0/F對(duì)［Q］作圖，結(jié)果見(jiàn)圖3，由猝滅曲線得到3 個(gè)不同溫度的KSV，見(jiàn)表1，從表1中的KSV可見(jiàn)，KSV隨著溫度的升高而升高，即當(dāng)殼聚糖質(zhì)量濃度一定時(shí)，ΔF隨著溫度的升高也逐漸升高。從以上結(jié)果可以初步判斷殼聚糖對(duì)活性紅4的熒光猝滅屬于動(dòng)態(tài)熒光猝滅，且由于動(dòng)態(tài)猝滅與擴(kuò)散有關(guān)，溫度升高時(shí)溶液的黏度下降，同時(shí)分子的運(yùn)動(dòng)加速，分子擴(kuò)散系數(shù)增大，從而增加

圖3　不同溫度條件下的Stern-Volmer圖Fig.3 Stern-Volmer plots of chitosan-Cibacron brilliant red 3B-A at different temperatures

表1　Stern-Volmer方程常數(shù)Table 1 Some parameters for Stern-Volmer plots

2.4共振瑞利散射圖譜

圖4　不同殼聚糖質(zhì)量濃度的共振瑞利散射圖譜Fig.4 RRS spectra of chitosan-Cibacron brilliant red 3B-A systems

參照1.3.2節(jié)方法，以λEx=λEm進(jìn)行同步掃描，記錄共振瑞利散射光譜，結(jié)果見(jiàn)圖4。在弱酸性的B-R緩沖溶液中，殼聚糖和活性紅4本身的散射光強(qiáng)度非常弱，但是，兩者結(jié)合后的共振瑞利散射光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，在波長(zhǎng)342 nm處呈特征性共振瑞利散射峰。這也由于在弱酸環(huán)境中，殼聚糖的氨基陽(yáng)離子與活性紅4的陰離子形成締合物時(shí)呈電中性，疏水性大大提高，導(dǎo)致在所結(jié)合產(chǎn)物與水相之間形成界面而產(chǎn)生一種表面增強(qiáng)的散射效應(yīng)，有利于共振瑞利散射光增強(qiáng)。此共振瑞利散射光增加強(qiáng)度與殼聚糖質(zhì)量濃度呈線性相關(guān)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇波長(zhǎng)342 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.5實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.5.1緩沖溶液及pH值的選擇

2.5.1.1熒光猝滅法緩沖溶液及pH值的選擇

按照1.3.1節(jié)方法，考察在HAc-NaAc緩沖溶液、六次甲基四胺-鹽酸緩沖溶液和緩沖范圍較寬的B-R緩沖溶液中，殼聚糖對(duì)活性紅4熒光猝滅強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明，在B-R緩沖溶液中，殼聚糖對(duì)活性紅4的熒光猝滅程度較強(qiáng)且體系靈敏度最高，在pH 3.50～5.50之間，熒光猝滅強(qiáng)度比較穩(wěn)定，在pH值為4.50時(shí)，ΔF達(dá)到最大值。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用pH 4.50的B-R緩沖溶液體系。

2.5.1.2共振瑞利散射法緩沖溶液及pH值的選擇

按照1.3.2節(jié)方法，考察B-R緩沖溶液、HAc-NaAc緩沖溶液、六次甲基甲胺-鹽酸緩沖溶液和甘氨酸-鹽酸緩沖溶液對(duì)共振瑞利散射強(qiáng)度ΔI的影響，研究發(fā)現(xiàn)在B-R和甘氨酸-鹽酸2 種緩沖體系中，測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)定性較好。但是，采用甘氨酸-鹽酸緩沖溶液時(shí)，測(cè)試液放置時(shí)間40 min后有白色的沉淀物析出，放置時(shí)間長(zhǎng)則干擾后續(xù)測(cè)定，故選擇B-R緩沖溶液。實(shí)驗(yàn)得出該緩沖體系pH值為5.50時(shí)，ΔI達(dá)到最大值，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇pH 5.50的B-R緩沖溶液。

2.5.2活性紅4溶液濃度的選擇

按照1.3.2節(jié)方法，在固定體系中殼聚糖質(zhì)量濃度的前提下，考察活性紅4濃度對(duì)體系熒光強(qiáng)度F和共振瑞利散射強(qiáng)度I的影響，同時(shí)測(cè)定試劑空白，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5。當(dāng)活性紅4溶液濃度為1.00×10-5mol/L時(shí)，殼聚糖對(duì)體系的熒光猝滅強(qiáng)度ΔF和共振瑞利散射光強(qiáng)度增強(qiáng)值ΔI最大。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)中熒光猝滅方法和共振瑞利散射方法均選用活性紅4濃度為1.00×10-5mol/L。

圖5　活性紅4溶液濃度的影響Fig.5 Effect of different concentrations of Cibacron brilliant red 3B-A

2.5.3緩沖溶液用量的選擇

按照1.3.2節(jié)方法，在固定殼聚糖質(zhì)量濃度和其他實(shí)驗(yàn)條件的前提下，考察不同B-R緩沖溶液加入量對(duì)體系熒光猝滅強(qiáng)度和共振瑞利散射光增強(qiáng)的影響。結(jié)果顯示當(dāng)B-R加入2.0 mL時(shí)，殼聚糖-活性紅4體系的熒光猝滅強(qiáng)度ΔF和共振瑞利散射光增強(qiáng)值ΔI最大。因此，濃度為1.0×10-5mol/L的活性紅4實(shí)驗(yàn)加入量選擇2.0 mL。

2.5.4反應(yīng)時(shí)間和穩(wěn)定時(shí)間

熒光猝滅法測(cè)定殼聚糖，測(cè)試液的熒光強(qiáng)度在5～60 min內(nèi)基本恒定，之后，隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，ΔF稍有上升。而共振瑞利散射法測(cè)定殼聚糖，測(cè)試液的共振散射光強(qiáng)度在120 min內(nèi)基本不發(fā)生變化，穩(wěn)定性良好。2.6 線性關(guān)系與檢出限

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，按照實(shí)驗(yàn)方法1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)分別測(cè)定不同質(zhì)量濃度殼聚糖測(cè)試液的熒光強(qiáng)度和共振瑞利散射光強(qiáng)度，同時(shí)測(cè)定相應(yīng)試劑空白，以ΔF、ΔI對(duì)試液中殼聚糖濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，運(yùn)算回歸方程。選取標(biāo)準(zhǔn)曲線中最低殼聚糖質(zhì)量濃度，平行制備13 份測(cè)試液，同時(shí)制備試劑空白（n=13），測(cè)定后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率［10］，算得2 種方法檢出限。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　測(cè)定殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)參數(shù)Table 2 Calibration curve equations with related parameters for the determination of chitosan

2.7共存物質(zhì)干擾

表3　共存物質(zhì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Effect of foreign substances on chitosan-Cibacron brilliant red 3B-A

目前，市場(chǎng)上含有殼聚糖的功能性食品以甲殼素膠囊為主，主要成分為殼聚糖，在其中加入輔料成分葡萄糖和淀粉等。

按照1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)方法，分別于殼聚糖質(zhì)量濃度為1.00 μg/mL和2.00 μg/mL的測(cè)試液中，加入甲殼素膠囊量品中可能的共存物質(zhì)，進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)測(cè)定，并將測(cè)定結(jié)果與未加干擾物質(zhì)的殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試液測(cè)定結(jié)果對(duì)照，計(jì)算產(chǎn)生約±5%相對(duì)誤差時(shí)加入各共存物質(zhì)的質(zhì)量濃度，結(jié)果見(jiàn)表3。甲殼素膠囊中可能的共存物質(zhì)如可溶性淀粉、檸檬酸、葡萄糖、甘氨酸及鉀、鈉等微量元素對(duì)測(cè)定結(jié)果干擾較小，部分金屬離子如Ca2+、Mg2+、Cu2+和Fe3+等對(duì)殼聚糖的測(cè)定影響較大，可以通過(guò)在量品中加入適量的乙二胺四乙酸掩蔽劑來(lái)消除金屬離子的干擾。

2.8殼聚糖分子質(zhì)量的影響

2.8.1熒光猝滅法

按照1.3.1節(jié)方法，取3 組10 mL比色管，分別加入低、中、高分子質(zhì)量的殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。3 組殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液系列質(zhì)量濃度均為0.05、0.10、0.20、0.30、0.50、1.00、2.00 μg/mL，同時(shí)制備試劑空白，各平行3 份。測(cè)定以上各測(cè)試液的熒光強(qiáng)度，計(jì)算相應(yīng)的ΔF值，繪制不同分子質(zhì)量殼聚糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 20.0對(duì)3 條標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行斜率顯著性檢驗(yàn)，得出3 條標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率沒(méi)有差異（P＞0.05），可以初步推斷采用此種方法測(cè)定殼聚糖含量，即使當(dāng)殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)與量品中殼聚糖的分子質(zhì)量存在較大差異時(shí)，基本不影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.8.2共振瑞利散射法

按照1.3.2節(jié)方法，取3 組10 mL比色管，參照2.8.1節(jié)制備低、中、高3 種殼聚糖分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用SPSS 20.0軟件對(duì)3 條標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行斜率顯著性檢驗(yàn)，得P＜0.05，可以得出，當(dāng)測(cè)定未知量品中的殼聚糖含量時(shí)，量品測(cè)試液測(cè)定數(shù)值以3 個(gè)不同分子質(zhì)量的殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算將得出3 個(gè)不同的結(jié)果，即殼聚糖定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確性受殼聚糖分子質(zhì)量的影響。

在此基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步探索共振瑞利散射法準(zhǔn)確定量殼聚糖的方法。首先，考察殼聚糖模量量品的量品曲線與上述3 種標(biāo)準(zhǔn)曲線之間的差異性。殼聚糖模量量品，由中分子質(zhì)量的殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)液中加入葡萄糖10 μg/mL、抗壞血酸5 μg/mL和甘氨酸20 μg/mL干擾物質(zhì)組成。按照2.8.1節(jié)中標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)量濃度，配制一定質(zhì)量濃度梯度的量品溶液，平行3 份，同時(shí)制備試劑空白。測(cè)定各模量量品測(cè)試液和試劑空白的共振散射光強(qiáng)度，計(jì)算ΔI值，繪制線性方程，與3 種分子質(zhì)量殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6　低、中、高分子質(zhì)量殼聚糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線以及模擬樣品曲線Fig.6 Standard curves for low， medium and high molecular weight chitosan and simulated sample

由圖6可知，模量量品曲線與中分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線基本重合。采用SPSS進(jìn)行斜率顯著性檢驗(yàn)，得出低、中、高分子質(zhì)量的殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線與模量量品4 條曲線之間存在差異（P＜0.05），而中分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線和模量量品曲線之間不存在差異（P＞0.05）。

模量量品驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。按照1.3.2節(jié)方法，取2 組10 mL比色管，模量量品加入量分別為2.50 μg/mL和3.50 μg/mL，各平行3 份，同時(shí)制備試劑空白，測(cè)定各測(cè)試液以及試劑空白的共振瑞利散射光強(qiáng)度值，計(jì)算相應(yīng)ΔI值，分別以低、中、高分子質(zhì)量殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算模量量品中殼聚糖質(zhì)量濃度，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　采用不同標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算模擬樣品的結(jié)果Table 4 Results calculated for one sample according to three standard curves

由表4數(shù)據(jù)得出，當(dāng)采用中分子質(zhì)量殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算模量量品測(cè)得結(jié)果時(shí)，計(jì)算結(jié)果誤差最小。依此進(jìn)一步驗(yàn)證，定量檢測(cè)未知量品中殼聚糖質(zhì)量濃度時(shí)，選取與量品曲線斜率接近的標(biāo)準(zhǔn)曲線作為計(jì)算基準(zhǔn)可以最大程度降低系統(tǒng)誤差。

2.9量品分析

2.9.1量品預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取殼聚糖膠囊粉末（奧利維和艾得蘭）0.040 0 g，用0.5 mol/L HAc溶液溶解，定容至100 mL，待完全溶解后于6 000 r/min離心15 min，取2.5 mL上清液，并加入0.01 mol/L的乙二胺四乙酸1.00 mL，定容至100 mL，此溶液作為量品操作液。

2.9.2量品含量測(cè)定及精密度、加標(biāo)回收率

按照1.3.2節(jié)方法，制備奧利維和艾得蘭2 種產(chǎn)品的量品曲線，發(fā)現(xiàn)2 種量品曲線均與低分子質(zhì)量殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率相當(dāng)。又由于熒光猝滅法測(cè)定殼聚糖基本不受標(biāo)準(zhǔn)物分子質(zhì)量的影響，因此，采用2 種方法檢測(cè)量品中殼聚糖質(zhì)量濃度時(shí)，均選擇低分子質(zhì)量殼聚糖為定量標(biāo)準(zhǔn)。

按照1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)方法，于10 mL比色管中加入一定體積的量品操作液，平行3 份，同時(shí)制備試劑空白和低分子質(zhì)量殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算量品中殼聚糖含量，結(jié)果見(jiàn)表5。熒光猝滅法與共振瑞利散射法測(cè)得的結(jié)果基本一致。同時(shí)做加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表6。熒光猝滅法平均加標(biāo)回收率為96.27%～105.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.95%～2.3%。共振瑞利散射法平均加標(biāo)回收率為95.85%～104.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.73%～4.9%。

表5　樣品測(cè)定結(jié)果Table 5 Determined results of the sample

表6　2 種測(cè)定方法的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=5）Table 6 Recoveries for spiked samples determined by two methods （n=5）

3　結(jié) 論

在弱酸性B-R緩沖體系中，利用殼聚糖與活性紅4的離子締合，建立了2 種定量分析殼聚糖的新方法：熒光猝滅法和共振瑞利散射法。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中系統(tǒng)考察了殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)的分子質(zhì)量大小對(duì)未知量品中殼聚糖準(zhǔn)確定量的影響，研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖-活性紅4熒光猝滅法基本不受殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量的影響，即當(dāng)殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的分子質(zhì)量與量品中殼聚糖分子質(zhì)量存在較大差異時(shí)也可以得出較滿意的結(jié)果，該方法具有準(zhǔn)確性和方便性。以活性紅4為探針的共振瑞利散射法測(cè)定殼聚糖與現(xiàn)有文

獻(xiàn)［13-14］報(bào)道的共振瑞利散射法測(cè)定殼聚糖相比，其靈敏度有較大提升，且通過(guò)此方法可以反映出不同分子質(zhì)量殼聚糖的差異，也可利用此方法初步判斷未知量品中殼聚糖的分子質(zhì)量大小。

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Fluorescence Quenching and Resonance Rayleigh Scattering Spectra of Chitosan-Cibacron Brilliant Red 3B-A Association System and Its Application for the Determination of Chitosan

ZHANG Weiai， WANG Gang， MA Caijuan， SU Zhengquan， BAI Yan*
（School of Public Health， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510310， China）

A novel method was presented for the determination of chitosan based on its quenching effect on the fluorescence of Cibacron brilliant red 3B-A in B-R buffer solutions. Under the condition of λEx/λEm= 285 nm/341 nm， the degree of fluorescence quenching of Cibacron brilliant red 3B-A was linearly proportional to the concentration of chitosan added in the range of 0.050-2.00 μg/mL and a linear equation was fitted as follows: ΔF = 68.78c + 2.648 （c: μg/mL） （R2= 0.999 2）. The detection limit of the fluorescence quenching method was 0.039 μg/mL. Moreover， chitosan-Cibacron brilliant red 3B-A ion-association complex showed a significant resonance Rayleigh scattering peak at 342 nm， and the intensity of resonance Rayleigh scattering was directly proportional to the concentration of chitosan. In the range of 0.050-6.00 μg/mL， linearity equation of chitosan-Cibacron brilliant red 3B-A system was ΔI = 681.31c+114.95 （c: μg/mL） （R2= 0.999 1） with detection limit of 0.033 μg/mL. Therefore， two methods （fluorescence quenching and resonance Rayleigh scattering） by using Cibacron brilliant red 3B-A as a probe have been established and validated for rapid determination of chitosan and chitosan capsules. Meanwhile， the effect of the molecular weight of chitosan on its accurate determination was also investigated. These two methods were applied in analysis of two real chitosan samples， and there was no significant difference in the results from the two methods with acceptable recoveries.

chitosan； Cibacron brilliant red 3B-A； fluorescence quenching； resonance Rayleigh scattering

10.7506/spkx1002-6630-201608031

O657.3

A

1002-6630（2016）08-0176-06

2015-07-01

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81173107）；廣東省創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（1057312018）

張偉愛(ài)（1988—），女，碩士研究生，主要從事環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測(cè)與衛(wèi)生檢驗(yàn)研究。E-mail：zhangweiai0629@126.com

白研（1970—），女，教授，碩士，主要從事衛(wèi)生檢驗(yàn)與藥物分析研究。E-mail：angell_bai@163.com

引文格式：