周 茜，韓 雪，韓曉梅，閆晨靜，白冰瑤，王唯霖，趙 文*

（河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北 保定 071000）

響應面試驗優(yōu)化烏梅熊果酸提取工藝及其對大腸桿菌的抑制作用

周 茜，韓 雪，韓曉梅，閆晨靜，白冰瑤，王唯霖，趙 文*

（河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北 保定 071000）

采用響應面法優(yōu)化超聲提取烏梅熊果酸的最佳條件。在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分數(shù)、料液比和超聲時間為影響因素，以烏梅熊果酸提取量為響應值進行響應面分析；并研究了烏梅熊果酸對大腸桿菌的抑制作用。結(jié)果表明，烏梅熊果酸提取最佳工藝條件為乙醇體積分數(shù)71%、料液比3∶44（g/mL）、超聲時間2.5 h，在此條件下提取量為（12.61±0.13）mg/g。烏梅熊果酸對大腸桿菌最低抑菌濃度為0.25 mg/mL；高劑量組（0.5 mg/mL）處理后與對照組相比，細胞壁和細胞膜通透性增加，培養(yǎng)液蛋白質(zhì)含量、核酸大分子物質(zhì)含量、Ca2+濃度和總漏出率分別增加了28、1.5、7 倍和0.8 倍；掃描電鏡觀察菌體有明顯變形或破碎現(xiàn)象，表明烏梅熊果酸對大腸桿菌生長具有抑制作用。

烏梅；熊果酸；響應面分析法；大腸桿菌；抑菌作用

周茜， 韓雪， 韓曉梅， 等. 響應面試驗優(yōu)化烏梅熊果酸提取工藝及其對大腸桿菌的抑制作用［J］. 食品科學， 2016， 37（8）: 67-73. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608012. http://www.spkx.net.cn

ZHOU Qian， HAN Xue， HAN Xiaomei， et al. Optimization of ursolic acid extraction from Fructus Mume and evaluation of its antibacterial activity against Escherichia coli［J］. Food Science， 2016， 37（8）: 67-73. （in Chinese with English abstract）DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608012. http://www.spkx.net.cn

烏梅，又稱酸梅、合漢梅，是梅果主要加工產(chǎn)品之一。梅是我國的一種特種資源，目前世界上僅在韓國、日本、新西蘭等少數(shù)國家人工栽培，其他國家和地區(qū)相對罕見。烏梅使用歷史悠久，具有斂肺澀腸、生津止渴、驅(qū)蟲止痢等功效，《神農(nóng)本草經(jīng)》中列為中品，是我國重要的藥食同源物品［1］。研究［2］表明，烏梅中含有多種活性物質(zhì)，包括有機酸、萜類、黃酮、酯類等，其中熊果酸是烏梅發(fā)揮藥理作用的有效成分之一。熊果酸具有抗炎癥、降血糖及免疫增強效果等多種生物學活性［3-5］。Zhang Tingting等［6］研究表明熊果酸可以通過抑制Toll量受體介導的炎癥途徑及改善機體氧化應激作用，對實驗性早期腦損傷起到保護作用。日本等國家已經(jīng)將其作為天然抗氧化劑應用于食品中，具有廣闊的應用前景和重要的開發(fā)利用價值［7］。

目前烏梅熊果酸的相關(guān)研究較少。王娟［8］采用乙醇提取烏梅熊果酸并進行響應面法優(yōu)化，熊果酸提取量為6.57 mg/g。紀曉花［9］對烏梅熊果酸抑菌效果進行初步研究，結(jié)果表明其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等4 種致病菌具有顯著抑菌作用。但是烏梅熊果酸提取量較低，制約了其生物活性的深入研究。因此本研究采用超聲輔助提取烏梅熊果酸并進行響應面試驗優(yōu)化，獲得最佳提取條件，提高烏梅熊果酸提取量；并從細胞膜和細胞壁通透性、蛋白質(zhì)含量、細胞內(nèi)容物及菌體形態(tài)等方面研究烏梅熊果酸對大腸桿菌的抑菌作用，以期為熊果酸及烏梅資源的綜合利用提供可靠的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

烏梅購于河北省保定萬寶堂藥房，60 ℃恒溫烘箱中烘干，多功能高速粉碎機粉碎，60 目過篩備用。

熊果酸對照品 中國食品藥品檢定研究院；香草醛、無水乙醇、高氯酸、冰乙酸（均為分析純） 天津市百納化工有限公司；營養(yǎng)瓊脂、酵母浸粉、瓊脂粉北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；牛肉浸膏、蛋白胨北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；實驗用水為蒸餾水。

大腸桿菌（Escherichia coli）保存于河北農(nóng)業(yè)大學微生物實驗室。

1.2儀器與設備

BL-100型高速多功能粉碎機 浙江省永康市松青五金工具廠；TU-1910紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；電子天平 常州稱重設備系統(tǒng)有限公司；SB-5200DTDN超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；SPX-150S-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；DDS-307A （DDB-600）型電導儀 上海精密科學儀器公司。

1.3方法

1.3.1烏梅熊果酸含量的測定［10-11］

1.3.1.1熊果酸標準溶液的配制

精密稱取干燥至質(zhì)量恒定的熊果酸標準品20.00 mg，置于50 mL容量瓶中，無水乙醇定容，獲得質(zhì)量濃度為400 μg/mL的標準溶液。準確吸取2.5 mL標準品溶液，定容至10 mL，即得質(zhì)量濃度為100 μg/mL的熊果酸對照品，待用。

1.3.1.2標準曲線繪制

準確吸取熊果酸標準品0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.0 mL，分別置于試管中，85 ℃水浴鍋中揮干溶劑，加入5%香草醛-冰乙酸溶液0.3 mL，搖勻；加入高氯酸1.0 mL，搖勻；60 ℃水浴溫育15 min，后置于冰水冷卻至室溫；加入冰乙酸5.0 mL，搖勻后放置15 min顯色，以空白試劑為參比，測定546 nm波長處吸光度。以熊果酸標準品含量（μg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制熊果酸標準曲線并得到回歸方程為：y=0.006 4x-0.013 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5。

1.3.1.3烏梅量品中熊果酸含量測定

準確吸取0.3 mL烏梅量品提取液，參照1.3.1.2節(jié)方法，測定456 nm波長處的吸光度。根據(jù)回歸方程計算烏梅熊果酸質(zhì)量。烏梅熊果酸提取量以單位烏梅質(zhì)量（g）含有的熊果酸質(zhì)量（mg）計算。

1.3.2烏梅熊果酸取工藝流程

烏梅（干燥）→粉碎→不同條件下超聲輔助浸提→離心→過濾→定容→測定吸光度→濃縮干燥→提取量計算

1.3.3烏梅熊果酸提取單因素試驗

1.3.3.1乙醇體積分數(shù)對提取效果的影響

準確稱取烏梅量品3.0 g共4 份，固定料液比3∶30（g/mL）、超聲時間2 h、超聲溫度50 ℃，考察乙醇體積分數(shù)為50%、60%、70%、80%、90%條件下烏梅熊果酸提取量。

1.3.3.2料液比對提取效果的影響

準確稱取烏梅量品3.0 g共4 份，乙醇體積分數(shù)用1.3.3.1節(jié)中選定的條件，固定超聲時間2 h、超聲溫度50 ℃，考察料液比為3∶20、3∶30、3∶40、3∶50、3∶60（g/mL）條件下烏梅熊果酸提取量。

1.3.3.3超聲時間對提取效果的影響

準確稱取烏梅量品3.0 g共4 份，乙醇體積分數(shù)用1.3.3.1節(jié)中選定的條件，料液比用1.3.3.2節(jié)中選定的比例，固定超聲溫度50 ℃，考察超聲時間為0.5、1、2、3、4 h條件下烏梅熊果酸提取量。

1.3.3.4超聲溫度對提取效果的影響

準確稱取烏梅量品3.0 g共4 份，乙醇體積分數(shù)用1.3.3.1節(jié)中選定的條件，料液比用1.3.3.2節(jié)中選定的比例，超聲時間用1.3.3.3節(jié)中選定的時間，考察超聲溫度為30、40、50、60、70 ℃條件下烏梅熊果酸提取量。

1.3.4烏梅熊果酸提取響應面試驗優(yōu)化［12-13］

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分數(shù)（X1）、料液比（X2）、超聲時間（X3）為自變量，以烏梅熊果酸提取量為響應值，根據(jù)響應面Box-Behnken試驗設計原理，對烏梅熊果酸提取的影響因素進行深入研究和條件優(yōu)化，并做出響應面圖，對響應面受多個變量影響的因素進行建模分析。試驗設計因素與水平見表1。

表1　Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken design

1.3.5烏梅熊果酸對大腸桿菌的抑制作用

依照響應面分析確定的最優(yōu)條件提取烏梅熊果酸。提取液5 000 r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)大孔凝膠樹脂純化后，回收洗脫液冷凍干燥即得烏梅熊果酸粉末。配制相應質(zhì)量濃度溶液進行大腸桿菌抑制作用研究。

1.3.5.1最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測定

采用瓊脂平板稀釋法測定烏梅熊果酸的MIC值［14］。將烏梅熊果酸倍比稀釋，使其在培養(yǎng)基中終質(zhì)量濃度為2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL，分別取1 mL加入培養(yǎng)皿中，倒入15 mL培養(yǎng)基，充分混勻。待冷卻凝固后，均勻涂布100 μL 104CFU/mL的對數(shù)生長期大腸桿菌菌懸液，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長情況。以無菌落生長的最低烏梅熊果酸稀釋含量為MIC。

1.3.5.2烏梅熊果酸對大腸桿菌細胞膜通透性的影響

將培養(yǎng)至對數(shù)期的大腸桿菌，分別加入烏梅熊果酸使其終質(zhì)量濃度為MIC和2MIC，37 ℃、150 r/min繼續(xù)培養(yǎng)。分別于0、2、4、6、8 h時取量，3 500 r/min離心10 min，取上清液，用電導儀測定其電導率［15］。以不含烏梅熊果酸的菌懸液為對照，重復3 次，取平均值。

1.3.5.3烏梅熊果酸對大腸桿菌細胞壁通透性的影響

分別于0、2、4、6、8 h時取1.3.5.2節(jié)中實驗組與對照組菌懸液，3 500 r/min離心10 min，取上清液，用試劑盒測定堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）的活性［16］，重復3 次，取平均值。

1.3.5.4烏梅熊果酸對大腸桿菌培養(yǎng)液蛋白質(zhì)含量的影響

分別于0、2、4、6、8 h時取1.3.5.2節(jié)中實驗組與對照組菌懸液，采用Bradford［17］方法測定菌液中蛋白質(zhì)含量，重復3次，取平均值。

1.3.5.5烏梅熊果酸對大腸桿菌細胞內(nèi)容物含量的影響

分別取1.3.5.2節(jié)中實驗組與對照組培養(yǎng)8 h菌懸液10 mL于離心管中，分別測定核酸大分子物質(zhì)含量、Ca2+濃度及總漏出率［18］。核酸大分子物質(zhì)含量測定：4 000 r/min離心5 min，取上清液，測定260 nm波長條件下的吸光度；Ca2+濃度測定：依照鈣試劑盒說明書測定上清液中Ca2+濃度；總漏出率測定：測定上清液600 nm波長條件下的吸光度。重復3 次，取平均值。

1.3.5.6掃描電鏡觀察

分別取1.3.5.2節(jié)實驗組與對照組菌懸液各5 mL，8 000 r/min 離心5 min收集菌體，2.5%戊二醛溶液固定4 h，磷酸緩沖液洗滌，依次使用體積分數(shù)50%、70%、90%和100%乙醇溶液對菌體進行脫水處理30 min。將脫水菌體涂片于蓋玻片上，自然風干，放入高真空蒸發(fā)器中，噴金鍍膜，掃描電鏡觀察細菌表面形態(tài)［19-20］。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗結(jié)果

圖1A結(jié)果顯示，乙醇體積分數(shù)在50%～70%范圍內(nèi)，烏梅熊果酸提取量呈現(xiàn)上升趨勢，且乙醇體積分數(shù)達到70%時提取量最高；但當乙醇體積分數(shù)大于70%時，提取量下降，提取溶劑的極性降低，可能會導致熊果酸溶解度下降，而其他脂溶性雜質(zhì)溶出量增加，影響烏梅熊果酸提取量，因此選擇70%的乙醇溶液作為提取溶劑。圖1B顯示，料液比在3∶20～3∶40的范圍內(nèi)，烏梅熊果酸提取量顯著增加，且料液比為3∶40時最高；但當溶劑用量繼續(xù)增加時，烏梅熊果酸提取量下降；當提取溶劑過少時，固液兩相濃度梯度小，使熊果酸有效物質(zhì)不能完全溶出；而溶劑過多會造成溶劑浪費并對后續(xù)分離純化步驟不利，因此選擇3∶40為最適提取料液比。圖1C結(jié)果顯示，在2 h內(nèi)，提取量隨超聲時間延長而增高，2 h時達到最大；但繼續(xù)延長超聲時間，提取量開始下降并且趨于平穩(wěn)，故選定2 h為最佳提取時間。圖1D結(jié)果顯示，提取量隨超聲溫度升高而平緩增加，但沒有顯著性差異，故超聲溫度對烏梅熊果酸提取的影響較小。

2.2響應面試驗與結(jié)果

2.2.1回歸模型的建立及方差分析

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分數(shù)（X1）、料液比（X2）、超聲時間（X3）為自變量，進行三因素三水平的響應面試驗設計，試驗設計與結(jié)果見表2。

利用Design-Expert 7.0軟件對表2數(shù)據(jù)進行多元回歸量合分析，獲得以烏梅熊果酸提取量為響應值的回歸方程：Y=11.77+0.36X1+0.44X2+0.35X3-0.36X1X2+ 0.14X1X3+0.10X2X3-1.07X12-0.51X22-0.60X32。

由表3可知，模型P=0.000 6＜0.01（極顯著），失量項P=0.189 4＞0.05（不顯著），說明此模型與試驗有較好的量合性，試驗誤差較小。相關(guān)系數(shù)R=0.956 9和調(diào)整系數(shù)=0.900 6也表明模型量合程度較好，總變異系數(shù)為2.63%，說明重現(xiàn)性較好，該模型可用于優(yōu)化烏梅熊果酸提取工藝條件。從各個因素顯著性水平差異可知，對烏梅熊果酸提取量影響大小為：料液比＞乙醇體積分數(shù)＞超聲時間。乙醇體積分數(shù)、料液比一次項和乙醇體積分數(shù)、料液比、超聲時間的二次項對烏梅熊果酸提取量的影響達到了極顯著水平（P＜0.01）；超聲時間一次項影響顯著（P＜0.05）；交互項X1X2對烏梅熊果酸提取量具有顯著影響（P＜0.05）；而其他因素交互作用不顯著。

表3　烏梅熊果酸提取優(yōu)化回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.2.2響應面分析

根據(jù)回歸方程得出不同因素的響應面和等高線，結(jié)果見圖2。

圖2　各因素交互作用對提取量影響的響應面Fig.2 RSM analysis for interactive effects of ethanol concentration，solid-to-solvent ratio and sonication time on extraction efficiency

從圖2a可知，曲面比較陡峭，說明乙醇體積分數(shù)、料液比對提取量影響都顯著；同時等高線是橢圓形，說明交互作用也非常顯著；當乙醇體積分數(shù)比較低時，提取量隨料液比變化不明顯；當乙醇體積分數(shù)在70%～72%之間時，提取量隨著溶劑用量增加而顯著提高，且能達到最大值。由圖2b可知，雖然乙醇體積分數(shù)和超聲時間單因素對提取量影響顯著，但兩者交互作用不顯著（P=0.371 6），響應面圖曲面相對陡峭，等高線圖接近圓形；從等高線圖中還可看出，保持乙醇體積分數(shù)不變，超聲時間太長不利于烏梅熊果酸提取；當超聲時間大于2.5 h時，提取量開始降低。由圖2c可知，料液比和超聲時間交互作用（P=0.492 1）不顯著；當料液比在3∶44之后時，提取量降低；同時，乙醇體積分數(shù)和料液比的交互作用與料液比和超聲時間的交互作用相比，前者等高線更接近于橢圓形，其對提取量作用比后者顯著。

2.2.3驗證實驗結(jié)果

根據(jù)回歸方程預測烏梅熊果酸超聲提取最優(yōu)工藝條件為乙醇體積分數(shù)71%、料液比3∶44、超聲時間2.5 h，該優(yōu)化條件下烏梅熊果酸提取量預測12.58 mg/g。為證明試驗結(jié)果與實際情況是否相符，以上述優(yōu)化條件做3 次平行，得到烏梅熊果酸提取量為（12.61±0.13）mg/g，與預測值無顯著性差異，說明此響應面法得到的回歸模型具有一定的可靠性。與王娟［8］研究結(jié)果相比，烏梅熊果酸提取量增加1 倍，具有較好應用前景。

2.3烏梅熊果酸的抑菌作用

2.3.1烏梅熊果酸對大腸桿菌的MIC

表4　烏梅熊果酸對大腸桿菌的MIC測定結(jié)果Table 4 MIC of ursolic acid against E. coli

由表4可知，烏梅熊果酸對大腸桿菌的抑制效果明顯，MIC值為0.25 mg/mL。

2.3.2烏梅熊果酸對大腸桿菌細胞膜通透性的影響

圖3　烏梅熊果酸對大腸桿菌細胞膜通透性的影響Fig.3 Effects of ursolic acid on the cell membrane permeability of E. coli

當外界環(huán)境不利于微生物生長時，菌體細胞內(nèi)K+、Na+等電解質(zhì)大量外漏，導致培養(yǎng)液電導率改變，從而反映細胞膜滲透性情況，同時電解質(zhì)離子的外漏導致細胞內(nèi)多種代謝途徑受阻，嚴重影響細菌的正常生長［21-22］。由圖3可知，不同質(zhì)量濃度烏梅熊果酸處理的大腸桿菌培養(yǎng)液電導率明顯高于對照組。隨著作用時間的延長，烏梅熊果酸處理的培養(yǎng)液電導率都呈現(xiàn)持續(xù)升高現(xiàn)象，且高質(zhì)量濃度烏梅熊果酸處理組的電導率變化顯著。這說明烏梅熊果酸處理后大腸桿菌菌體細胞質(zhì)發(fā)生滲漏，電解質(zhì)滲出量不斷增大，細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性被破壞，從而破壞菌體細胞，達到抑菌效果。

2.3.3烏梅熊果酸對大腸桿菌細胞壁通透性的影響

圖4　烏梅熊果酸對大腸桿菌細胞壁通透性的影響Fig.4 Effects of ursolic acid on the cell wall permeability of E. coli

AKP是存在于細胞壁與細胞膜之間的一種酶，正常情況下胞外液中檢測不到其活性。當細胞壁受到破壞后，透性增加，AKP會泄漏到胞液中，所以通過檢測細胞外AKP活性的變化可以反映細胞壁的通透性［23-25］。由圖4可知，隨著作用時間延長，不同質(zhì)量濃度處理組的大腸桿菌培養(yǎng)液中AKP活性持續(xù)上升，當達到6 h時，活性達到最高值，隨后趨于平穩(wěn)狀態(tài)，且活性高于對照組。說明烏梅熊果酸處理對大腸桿菌細胞壁有很強的破壞作用。

2.3.4烏梅熊果酸對大腸桿菌培養(yǎng)液蛋白質(zhì)含量的影響

圖5　烏梅熊果酸對大腸桿菌蛋白質(zhì)含量的影響Fig.5 Effects of ursolic acid on the protein content of E. coli

由圖5可知，不同質(zhì)量濃度烏梅熊果酸對大腸桿菌培養(yǎng)液蛋白質(zhì)含量具有顯著影響，當作用時間超過2 h時，蛋白質(zhì)含量快速增加，6 h時達到最高，但隨著作用時間繼續(xù)延長，變化不大。當作用時間為6 h時，MIC、2MIC烏梅熊果酸處理及對照組的蛋白質(zhì)含量分別為610.49、620.38、21.4 μg/mL，烏梅熊果酸顯著改變大腸桿菌細胞的膜透性，使細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)滲漏到胞外培養(yǎng)液中。但MIC和2MIC烏梅熊果酸處理的差異不顯著。

2.3.5烏梅熊果酸對大腸桿菌細胞內(nèi)容物含量的影響

表5　烏梅熊果酸對大腸桿菌細胞內(nèi)容物含量的影響Table 5 Effects of ursolic acid on the intracellular constituents of E. coli

如表5所示，大腸桿菌經(jīng)烏梅熊果酸處理8 h后，不同處理組的核酸大分子物質(zhì)含量、Ca2+濃度和總漏出率與對照組相比，均具有差異顯著性。不同質(zhì)量濃度烏梅熊果酸處理的核酸大分子物質(zhì)含量和總漏出率沒有顯著差異。高質(zhì)量濃度烏梅熊果酸處理的Ca2+濃度顯著高于低質(zhì)量濃度處理。

2.3.6掃描電鏡觀察結(jié)果

圖6 大腸桿菌的掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron micrograph of E. coli

圖6顯示，不同處理組大腸桿菌菌體都發(fā)生明顯變化。MIC烏梅熊果酸處理的大腸桿菌菌體邊緣模糊，菌體間界限不明顯，發(fā)生聚集現(xiàn)象；且菌體細胞表面粗糙，有凹陷和皺縮痕跡。2MIC烏梅熊果酸處理的大腸桿菌呈不規(guī)則狀態(tài)，菌體出現(xiàn)破碎，并伴隨有碎片產(chǎn)生。對照組大腸桿菌，菌體邊緣整齊、形狀規(guī)則，未發(fā)現(xiàn)明顯變化。說明烏梅熊果酸能夠有效抑制大腸桿菌的生長。

3　結(jié) 論

通過單因素試驗和響應面優(yōu)化分析，影響烏梅熊果酸提取量大小的因素順序為料液比、乙醇體積分數(shù)和超聲時間，其中料液比與乙醇體積分數(shù)因素之間的交互作用顯著。通過響應面得到烏梅熊果酸提取最佳工藝條件為：乙醇體積分數(shù)71%、料液比3∶44（g/mL）、超聲時間2.5 h。在該優(yōu)化條件下，烏梅熊果酸提取量為（12.61±0.13）mg/g。

烏梅熊果酸對大腸桿菌的MIC值為0.25 mg/mL，隨著烏梅熊果酸質(zhì)量濃度增大，其抑菌效果也逐漸增強。經(jīng)過0.5 mg/mL烏梅熊果酸處理后，大腸桿菌細胞壁、細胞膜通透性明顯增加，培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)含量、核酸大分子物質(zhì)、Ca2+濃度和總漏出率分別增加了28、1.5、7 倍和0.8 倍，掃描電鏡觀察菌體有明顯變形或破碎現(xiàn)象。烏梅熊果酸主要是通過破壞菌體細胞壁和細胞膜的完整性，引起細胞內(nèi)容物的外漏，從而發(fā)揮對大腸桿菌的抑制作用。

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Optimization of Ursolic Acid Extraction from Fructus Mume and Evaluation of Its Antibacterial Activity against Escherichia coli

ZHOU Qian， HAN Xue， HAN Xiaomei， YAN Chenjing， BAI Bingyao， WANG Weilin， ZHAO Wen*
（College of Food Science and Technology， Agricultural University of Hebei， Baoding 071000， China）

The conditions for ultrasound-assisted extraction of ursolic acid from Fructus Mume were optimized by response surface methodology （RSM）. Based on the results of single-factor tests， three factors including ethanol concentration， solidto-liquid ratio and extraction time were identified as main variables that affect extraction efficiency. Optimization of the three factors was performed using extraction efficiency of ursolic acid as the response. Besides， the antibacterial effect of ursolic acid on Escherichia coli was studied. The optimum extraction conditions were determined as follows: ethanol concentration， 71%； solid-to-liquid ratio， 3:44 （g/mL）； and extraction time， 2.5 h. Under these conditions， the yield of ursolic acid was （12.61 ± 0.13） mg/g. The antibacterial test showed that the minimal inhibition concentration of ursolic acid against E. coli was 0.25 mg/mL. After treatment with 0.5 mg/mL ursolic acid， the cell wall and membrane permeability of E. coli was increased and the contents of protein， nucleic acid materials， Ca2+and total leakage were enhanced by 29， 2.5， 8 and 1.8 folds compared to control， respectively. The scanning electron microscopic observation of E. coli showed that the cells were obviously destroyed or broken， indicating that ursolic acid has inhibitory effect on the growth of E. coli. The study can lay the theoretical basis for the application of ursolic acid and Fructus Mume in the future.

Fructus Mume； ursolic acid； response surface methodology； Escherichia coli； antibacterial effect

10.7506/spkx1002-6630-201608012

R284.5

A

1002-6630（2016）08-0067-07

2015-07-01

河北省科技計劃項目（13226602D）

周茜（1986—），女，講師，博士，研究方向為天然活性物質(zhì)研究與食品安全。E-mail：zhouqianyz513@126.com

趙文（1962—），女，教授，碩士，研究方向為營養(yǎng)分析與食品安全。E-mail：13582820221@163.com

引文格式：